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[摘要] 目的:研究缬草属药用植物中极性成分HPLC 指纹图谱及测定方法。方法:采用HPLC/ UV 测定缬草属药用植物甲醇提取液的指纹图谱。结果:建立了缬草属药用植物极性成分的HPLC 指纹图谱,发现了12 个色谱峰为共有峰,确定了其相对保留时间和峰面积比值的范围。结论:利用缬草属药用植物极性成分的指纹图谱可以对不同种缬草属植物进行鉴别,并可在一定程度上进行质量控制。 [关键词] 缬草属;HPLC指纹图谱;绿原酸;橙皮苷 缬草属Valeriana L 植物药用历史久远,蜘蛛香V. jatamansi Jones 早在我国明代的《本草纲目》中就有记载,主治脘腹胀痛、消化不良、腹泻、痢疾等疾病,1977 年版《中国药典》一部曾加以收载[1]。缬草V. officinalis L. 根和根茎入药,性平味辛,具有镇静安神,解痉止痛之功,主治心神不安,心悸失眠,癫狂,脏躁,风湿痹痛,脘腹胀痛,痛经,经闭,跌打损伤[2 ] 。一直以来,作为温和的镇静、安神、催眠药,其药用价值在世界上受到高度重视[3] ,且作为高档烟用香精原料,不少国家已经对其进行开发,产值不菲。关于缬草属药用植物的质量控制和分析方法报道不多,对其极性成分指纹图谱的研究未见报道。为了深入了解我国缬草属药用植物资源,从中寻找疗效确切的具有镇静作用的国产新资源,使其得到充分合理的利用,同时也为了更有效地控制缬草类药材的品质,作者采用HPLC/ UV 对其极性成分指纹图谱进行了研究。 1 仪器及试药 HP1050 型高效液相色谱仪,二极管阵列检测器。乙腈为色谱纯(美国Fisher 公司) ;水为娃哈哈纯净水,并经0. 45μm 水系滤膜过滤;绿原酸购于中国药品生物制品检定所; 橙皮苷自行提取精制,经UV ,IR ,NMR 等鉴定结构,纯度大于9915 %(归一化法计算) 。实验中所用缬草属药用植物均经笔者鉴定,见表1。 2 方法 2.1 色谱条件 默克C18色谱柱(4 mm ×125 mm , 5μm) ,预柱为C18柱(8 mm×10mm, 5μm)。柱温40℃,流速0.95 mL/min ,检测波长280 nm。乙腈和水每100 mL 分别加0.1 moL/L的磷酸1 mL 。梯度洗脱条件： 2min乙腈/ % 4水/ % 96；6 min乙腈/ % 5水/ % 95；9 min乙腈/ % 8水/ %92；20 min乙腈/ % 8. 7水/ % 91. 3；24 min 乙腈/ % 12. 5水/ %87. 5；30 min乙腈/ % 13水/ %87；50 min乙腈/ % 14水/ %86；60 min乙腈/ % 15水/ %85。 2.2 供试品溶液的制备：精密称取各样品粉末(经20 目筛) 10 g , 包在滤纸筒中,置索氏提取器内,用正己烷水浴回流提取至无色。将提取后的药材粉末干燥,再用二氯甲烷、甲醇依次同上法提取至无色。甲醇提取液浓缩至25 mL ,放冷,过滤,取滤液再过0145μm 微孔滤膜为供试品溶液。 2．3 对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、橙皮苷,加甲醇制成每1 mL 甲醇含绿原酸3.2 mg ,橙皮苷3.2 mg 的溶液作为对照品溶液。 2．4 精密度及稳定性考察：取同一份缬草属药用植物(实验编号4) 的供试液重复进样5 次,比较不同色谱峰的绝对保留时间、相对保留时间及峰面积比值。因进样间隔时间为90 min ,故同时对该方法进行了稳定性考察。结果表明所标定色谱峰的绝对保留时间、相对保留时间及峰面积比值基本一致(RSD 分别为0.02 %～2.3 % ,0～1.9 % ,0～2.7 %) ,符合指纹图谱检测要求[4 ] 。 2.5 重复性实验 取缬草属药用植物(样品编号4) 样品5 份,分别精密称定,按2.2 项方法制备供试品溶液,并分别按上述液相色谱条件测定,计算不同指纹峰的相对保留时间及峰面积比值。结果表明所标定色谱峰的绝对保留时间、相对保留时间及峰面积比值基本一致(RSD 分别为0101 %～0136 % ,0～0175 % ,0～216 %) ,符合指纹图谱检测要求[4 ] 。 3 缬草属药用植物极性成分的HPLC 指纹图谱及技术参数 3.1 缬草属药用植物极性成分的HPLC 指纹图谱及共有峰的标定：按上述液相色谱条件对7 份缬草属药用植物样品(表1 中的1～7 号样品) 进行了测定,样品中所有成分的色谱峰在60 min 之内出完,比较各样品的色谱图,其中12 个峰是共有的,确定为指纹峰(见图1) 。各共有峰的紫外吸收(共有峰峰号) 为:202 ,256 nm(3) ,218 ( sh) ,324 nm(4 ,9 ,10 ,12) ;202 ,276 nm(5 ,6 ,8) ;202 (sh) ;282 nm(7 ,11) 。 3.2 共有峰保留时间及峰面积的比值确定：以绿原酸为参照,把各色谱峰保留时间与同一图谱中绿原酸保留时间的比值作为各色谱峰的相对保留时间。结果各共有峰峰号( 相对保留时间) 为: 1(0.11) ,2 (0.70～0.73) ,3 (0.85～0.86) ,4 (1.00) ,5(1.12 ～ 1.14) , 6 ( 1.23 ～ 1.26) , 7 ( 1.68 ～ 1.70) , 8(1.96～1.99) ,9 (2.52～2.58) ,10 (2.75～2.80) ,11(2.85～2.90) ,12 (3.31～3.39) 。精密吸取对照品溶液10μL ,按上述色谱条件测定,以所得的绿原酸峰面积作为1 ,计算各样品图谱中色谱峰的峰面积比值,结果各共有峰的峰号(峰面积比值) 为:1 (0.03～0.10) , 2 (0.05 ～ 0.10) , 3 ( 0.06 ～ 0.09) , 4 ( 0.79 ～1.40) , 5 (0.07 ～ 0.11) , 6 ( 0.06 ～ 0.08) , 7 ( 0.23 ～0.38) ,8 (0.16 ～0.18) , 9 (0.09 ～0.27) , 10 (0.31 ～0.91) ,11 (0.27～1.52) ,12 (0.25～0.97) 。7 号峰和12 号峰有时出现肩峰。 3.3 不同来源的样品HPLC 图谱的比较：笔者同时采用上述液相色谱条件测定了几种不同植物来源的缬草属植物样品(表1 中的8～16 号样品) ,见图2。各样品极性成分的HPLC 图谱与所建立的缬草属药用植物极性成分的指纹图谱比较结果见表3。结果表明,其他植物来源的各缬草属药用植物的样品的极性成分HPLC 图谱与来源于蜘蛛香的样品差别明显,对缬草属药用植物的真伪鉴别有重要意义。 4 讨论 4.1 笔者建立了缬草属药用植物极性成分的HPLC测定方法,该方法能使缬草属药用植物甲醇提取物中的大部分化学成分得到较好分离,具有很好的稳定性、重复性和可行性。 4.2 在液相色谱条件建立的过程中,笔者比较了波长190～400 nm 所测得的HPLC 图谱(DAD 检测器检测) ,结果表明,波长280 nm 检测时,其HPLC 图谱中可见比较多的色谱峰,同时各色谱峰分离较好;并且该波长接近所选用对照品绿原酸的最大吸收波长;故确定波长280 nm 为检测波长。 4.3 本实验所应用的峰面积比值计算方法不同于文献[5 ] 。由于缬草属药用植物不同样品HPLC 指纹图谱中,各共有峰的峰面积均有一定的波动,故笔者认为不宜把各样品色谱图中某一共有峰峰面积均作为1 来计算峰面积比值。因此,本实验以已知浓度的绿原酸参照物溶液,固定体积进样后,同样色谱条件所得峰面积作为1 ,计算峰面积比值。样既消除了一定的系统误差,又能客观地反映不同样品中各共有峰所代表的化学成分的含量高低。通过缬草属药用植物指纹图谱主要特征峰的面积比例的制定,亦能有效地控制中药缬草的质量,确保缬草样品质量的相对稳定。 4.4 利用所建立的缬草属药用植物极性成分的HPLC 指纹图谱的特征性(如其稳定的共有峰相对保留时间) ,有效地区分了所收集的来源于蜘蛛香的样品和其他植物来源的样品,对缬草类药材的鉴别具有重要意义。 蜘蛛香、缬草、宽叶缬草、黑水缬草、长序缬草,这5 种植物药材极性成分的HPLC 图谱相互之间存在较大差别;而同一植物来源的不同样品极性成分的HPLC 图谱基本一致,其差别明显小于不同植物的样品HPLC 图谱;鉴于几种缬草样品性状、显微特征及原植物形态较相近,故可以认为从化学成分的角度进行区分应该是有效的途径,可以从化学分类上为缬草属这几种植物的分类提供佐证。 另外,本研究结果也提示,在制定指纹图谱的过程中,对于多来源的中药材,应把不同植物分别进行研究。 4.5 从结构和性质上说,由于缬草属药用植物的脂溶性成分中含有倍半萜、环烯醚萜等不稳定组分,化学结构复杂易变,化学性质极其活泼,在制备过程中受酸、碱、热等较剧烈条件影响,易发生断键、开环、异构化作用,难以获得稳定的标准物质。因此,对缬草属药用植物而言,其脂溶性成分可能不适宜做HPLC 指纹图谱。 |
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