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关键词:新疆紫草;高效液相;指纹图谱 摘要:目的:建立了新疆紫草高效液相指纹图谱,并将其作为鉴别方法进行了验证。方法:采用高效液相法确定了适宜的色谱条件并对7个不同产地的新疆紫草和3个产地的硬紫草中所含组分进行综合评价并测定了其左旋紫草素的含量。结果: 7个不同产地的新疆紫草指纹图谱主要特征大致相同,其主要成分之一左旋紫草素的含量与对照药材比无显著性差异,而3个产地的硬紫草与对照药材比指纹图谱主要特征及左旋紫草素的含量都有较大差异。结论:该指纹图谱可作为新疆紫草鉴别方法之一,为新疆紫草质量控制提供了依据。 新疆紫草A rnebia euchrom a (Royle) Johnst是紫草科软紫草属植物,也叫新疆软紫草,是我国常用中药材,药用部位是其干燥的根,收载于《中华人民共和国药典》,具有清热凉血、解毒透疹之功。研究表明其有效成分紫草素及其衍生物含量比其他紫草高三倍以上,因品质好列为药典收载品种之首,而行销国内外,有道地药材之誉。紫草素及其衍生物有抗菌、抗炎、促进肉芽组织生长、抗绒毛上皮癌等多种生理病理功能。临床上用于治疗肝炎、静脉炎、血管性紫癜、银屑病、烧伤等多种疾病。药典中收载了薄层色谱鉴别和分光光度法对总色素的测定。因其成分复杂,只以一化学成分评价其质量,不能反映紫草的全部药理作用,因此本文以高效液相为手段,采用指纹图谱对其质量进行控制,并为其鉴别提供依据。 1 仪器和材料 Aliance 2695高效液相色谱系统(脱气机、四元泵、柱温箱、PDA2996, Empower化学工作站,美国Waters公司产品) ,甲醇为色谱纯,水为超纯水, 0. 45μm针筒式滤器,新疆紫草对照药材、左旋紫草素标准品购自中国药品生物制品检定所。乌市、巴州1、巴州2、阿富汗、哈密、温泉、硬紫草1、硬紫草2、硬紫草3 等紫草药材购自原产地及河北安国药材市场,并经我院中药鉴定室李永和教授鉴定确认。 2 实验方法 2. 1 色谱条件 色谱柱, Symmetry shield Rp18 ( 150 mm ×3. 9 mm, 5μm) ,检测波长516 nm,柱温(35 ±5) ℃,流动相,A液-水,B液-乙腈,进样量20μL,检测时间60 min。 2. 2 左旋紫草素标准溶液制备 精密称取左旋紫草素标准品3. 8 mg,加甲醇定容至10 mL,配成0. 38 mg/mL 溶液备用。 2. 3 药材对照品的制备 精密称取新疆紫草对照品1 g,加甲醇15 mL,超声提取90 min,过滤后定容至20 mL,放4 ℃冰箱备用。 2. 4 供试液的制备 将乌市、巴州1、巴州2、阿富汗、安国、温泉、对照药材7产地的新疆紫草药材经干燥后进行粉碎,精密称取各样品粉末1 g,加甲醇15 mL,超声提取90 min,过滤后定容至20 mL,放4 ℃冰箱备用。 2. 5 样品分析 将新疆紫草对照药材和乌市、巴州1、巴州2、阿富汗、安国、温泉产的新疆紫草药材制成的供试液,按上述色谱条件进行分析(图1) ,得各样品的HPLC图谱相应峰的各种数值,同时用左旋紫草素标准品溶液进样,确定左旋紫草素的出峰时间,以测左旋紫草素的含量。 3 方法学考察 3. 1 系统适应性试验 按色谱条件进行,以左旋紫草素计算理论塔板数大于5000,分离度大于1. 5,对称因子为1. 05。 3. 2 精密度试验 取供试品溶液,连续测定5次,共有峰相对保留时间RSD < 2. 0% ,共有峰相对峰面积RSD < 2. 1%。 3. 3 重现性试验 取供试品同法制备5份溶液进行测定,共有峰相对保留时间RSD < 2. 4% ,共有峰相对峰面积RSD< 2. 3%。 3. 4 稳定性试验 取供试品溶液,分别于0, 6, 12, 18, 24 h测定,共有峰相对峰面积RSD < 3. 0%。 4 实验结果 4. 1 相对保留值指纹谱的建立 根据公式计算各样品色谱峰的a值和RA值,凡是a值相同或相近,最大吸收波长、比吸收值都相等的峰,即可认为同一化合物峰,将各个样品每个峰的RA列在相应的a值项下,某a值项无相应峰的样品其RA值为0,得到相对保留值指纹谱。 4. 2 样品之间的相似性 计算各个样品两两之间的峰重叠率并列表,组成反映样品间相似性的峰重叠率距阵,该距阵为对称矩阵,只列出一半即可。 4. 3 样品的HPLC的8强峰 各个样品均选出其中峰面积最大的8个峰排列成表,得5个样品的8强峰。 4. 4 特征指纹峰 根据样品中的8强峰及各色谱峰出现的频率,选出a值为0. 09, 1. 00, 1. 21, 1. 48, 1. 65, 1. 91, 1. 95共7个峰为本实验所研究新疆紫草的特征指纹峰。现将7个样品的特征指纹峰检出情况列于表6中,并列出左旋紫草素的含量,以规定两者之间的相关性。 从表6可以看出6产地新疆紫草中的化学组分与对照药材相比,大致相同,其主要组分基本相同,其中巴州1、巴州2、阿富汗、温泉产地新疆紫草中左旋紫草素的含量与对照药材相比无显著性差异(P > 0. 05) ,而乌市、安国中左旋紫草素的含量与对照药材相比有显著性差异( P < 0. 05)另外6产地新疆紫草药材的特征峰检出率除阿富汗为85. 7%外,其余均为100% ,说明各样品之间的化学成分相似性较高。 4. 5 鉴定 根据制定出的特征指纹峰,应用特征峰检出率、重叠率、左旋紫草素含量其对其他紫草进行鉴定,以检验其可靠性,见表7。 取硬紫草1、硬紫草2、硬紫草3与对照药材对比根据制定出的特征指纹峰,应用特征峰检出率、重叠率、左旋紫草素含量其对其他紫草进行鉴定,结果从表7看出,它们的特征峰检出率均为71. 4% , 重叠率分别为74. 07%、53. 85%、61. 54% ,左旋紫草素含量0. 0073、0. 011、0. 0098、0. 136与新疆紫草相比特征峰检出率均低于80% ,重叠率均低于76% ,左旋紫草素含量均低于0. 011%。 5 讨论 根据实验结果可知6产地新疆紫草品质与新疆紫草对照药材基本相同,均为真品,其中巴州1、巴州2药材品质较好,而3 产地硬紫草样品均非新疆紫草。本研究采用了HPLC技术,以新疆紫草对照药材为基础,建立了新疆紫草的指纹谱。在实验色谱条件下,能得到较多的色谱峰且分离效果好,椐此所得的相对保留值也十分稳定,所建立的色谱指纹谱具有较大的稳定性和可控性。我们认为该方法能得到新疆紫草药材所含组分的大量信息,其指纹谱能反映新疆紫草药材的内在品质。可用于新疆紫草药材品质和真伪品的鉴别。 |
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