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[摘要]目的:采用RP-HPLC建立注射用复方荭草(冻干粉针)的指纹图谱检测标准。方法:用Inersil-ODS-3色谱柱,乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱;流速1.0mL/min;检测波长300nm。结果:在相同色谱条件下获得药材、中间体和制剂的色谱图各色谱峰分离较好,制剂与药材、中间体的指纹图谱有良好的相关性,达到指纹图谱的技术要求。结论:指纹图谱17个共有峰的相对保留时间及峰面积比值,可作为注射用复方荭草(冻干粉针) 质量控制的重要依据之一。 [关键词]注射用复方荭草(冻干粉针);荭草;高效液相色谱;指纹图谱 注射用复方荭草(冻干粉针) 是在贵州民族用药的基础上研制的中药新药,已批准进入临床研究。本品以荭草为君药,采用现代制备工艺研制而成,具有化瘀通络,活血止痛功能。临床用于冠心病心绞痛心血瘀阻证。化学成分主要含黄酮类和酚酸类化合物,经药效学试验该类化合物为主要有效成分。根据注射剂指纹图谱的技术要求,采用HPLC对制剂的指纹图谱进行研究,分别建立了药材、中间体和制剂的HPLC指纹图谱检测标准,以期对制剂的质量控制提供有效的方法。 1 材料、仪器 注射用复方荭草(冻干粉针,共10批,贵阳医学院药物研究所研制) 。荭草Polygonum orientale L(贵州省惠水县,8～9月采收,贵阳医学院药物研究所生药学研究室龙庆德副教授鉴定) 。野黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号8802200001)。乙腈、甲醇均为色谱纯( 美国TIADIE) ;水为市售乐百事纯净水;乙醚、正丁醇、磷酸等试剂均为分析纯。 岛津LC-10ATvp泵,岛津SPD-10Avp检测器;TC-100色谱柱恒温箱(天津特纳科技公司);威马龙色谱工作站(广西南宁威玛龙色谱科技有限公司)。贝克曼高效液相色谱黄金系统,包括125泵,168阵列二极管检测器(波长190～600 nm) ,Alltech色谱柱恒温箱,32Karate色谱工作站。 2 方法及结果 2.1 色谱条件 Inersil ODS-3 色谱柱(4.6mm ×250mm,5μm) 。流动相A 0.1%磷酸溶液,B 80%乙腈,梯度洗脱:0～45min ,B (17%～27%) ;45～90min ,B (27%～70 %);90～100min ,B 保持70%。流速1.0mL/min ;柱温35℃;检测波长300nm;进样量20μL。 2.2 对照品溶液制备 精密称取野黄芩苷对照品适量,加甲醇制成每1mL 含0.15mg 的溶液,摇匀,即得。 2.3 供试品溶液制备 取本品25mg ,置25mL 量瓶中,加水适量,溶解,用水稀释至刻度,摇匀,即得。 2.4 精密度试验 取供试品溶液,连续进样5次,检测指纹图谱。结果表明各共有峰的保留时间比值和峰面积比值基本一致,保留时间比值的RSD均小于0.44%;峰面积比值的RSD小于0.68%,符合指纹图谱技术要求。 2.5 稳定性试验 取供试品溶液,分别在0 ,2 ,4 ,8 ,12 ,24h 检测指纹图谱,结果显示,样品在12h内各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD分别小于0.74%和1.8% ,符合指纹图谱技术要求。 2.6 重复性试验 取同一批号的制剂5份,制备供试品溶液,分别进样,检测指纹图谱。结果表明各共有峰的保留时间比值和峰面积比值基本一致,保留时间比值的RSD小于1.1%;峰面积比值的RSD小于0.72%,符合指纹图的要求。 2.7 样品测定 精密吸取参照物溶液、制剂供试品溶液各20μL ,分别注入液相色谱仪,测定。记录70min 色谱图,10批制剂供试品溶液测定结果。以野黄芩苷色谱峰(S峰)的保留时间及峰面积为1,计算各指纹峰的峰面积比值及相对保留时间,峰面积比值,非共有峰面积百分比在0.6 %～2.7% ,共有峰的峰号(相对保留时间)分别为:1(0.125),2(0.204),3(0.390) ,4(0.551),5 (0.604),6(0.651),7(0.700),8(0.771),9(0.803),10 (0.824), 11(0.867),12(0.900),13(0.960),S(1.000),14(1.185),15(1.376),16(1.751)。 3 讨论 3.1 共有指纹峰的标定 通过对10批制剂供试品溶液的HPLC的分析,其中17个峰为各批供试品所共有,因此确定17个峰为共有指纹峰,在共有峰中,以野黄芩苷峰面积最大和最稳定,以该峰作为S峰,单峰面积大于10%小于20%的峰为4,5号峰,计算其相对峰面积,其余峰按其相对保留时间定性。 3.2 色谱条件选择了KROMASIL C18 (5.0mm×200mm ,5μm) ,HypersilC18(5.0mm×250mm,5μm),Diamonsil C18 (4.6mm×250mm,5μm),Inersil ODS-3(4.6mm×250mm,5μm) 等色谱柱;用甲醇20.5%醋酸、乙腈20.5%醋酸、乙腈20.1%磷酸为流动相梯度洗脱。结果Inersil ODS-3色谱柱,乙腈20.1%磷酸梯度洗脱可对2种药材、中间体及制剂进行指纹图谱检测,并且获得良好的分离。 3.3 采用二极管阵列检测器对药材、中间体和制剂的指纹图谱检测波长进行了选择,结果表明检测波长在300 nm 时,药材、中间体和制剂的色谱信息量较大,基线平稳,各色谱峰分离较好。 3.4 在相同色谱条件下对药材、中间体和制剂进行指纹图谱检测,制剂中各特征峰均可在药材和中间体中得到追踪,结果表明,注射剂17 个共有峰与药材14个、中间体16 个共有峰相对应,药材、中间体和制剂的指纹图谱有良好的相关性。 3.5 采用国家药典委员会组织编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件,对10批制剂指纹图谱相似度进行计算,相似度均大于0.9。 |
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