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在滚环扩增过程中，研究者的一个细微但非常有价值的实验改进，导致了有用的无细胞克隆技术的诞生。
尽管人们正试图开发出DNA克隆与扩增的快速替代方法，但由于大肠杆菌类方法的可靠性，它仍然是一种可供选择的有用技术。现在的问题是，这类方法的效果有时候并不理想。Clyde Hutchison及其在J. Craig Venter研究所工作的同事就碰到了这样的情况。“我们手里有一些DNA片段，它们不能利用大肠杆菌这类方法进行克隆，因而迫使我们寻找像无细胞克隆这样的方法来解决问题，” Hutchison说。这样的情况是在利用 29DNA聚合酶进行无细胞克隆的实验方法中得到了体现。 这些研究者非常熟悉 29DNA聚合酶，因为他们以前的工作就包括合成一种 X174 抗菌素基因组。进行现在的研究很符合逻辑，因为早在2001年，Lasken及其同事就报道说他们开发的 29滚环扩增法能够进行可靠的无细胞克隆。Hutchison指出：“我们认为我们应该可以完成单分子扩增的实验，但结果发现，在额外模板不存在的情况下进行DNA合成难度很大。”但是，通过大量降低反应量，他们最后克服了这一困难。这样以来，他们可对几个K长度的DNA单分子片段成功进行克隆，最终实现了双螺旋DNA的无细胞克隆。 该方法的这一改进虽然细微，但非常重要，在很多应用领域中都非常有用。其中一个最明显的例子就是抗菌素的测序工作。Hutchison这样描述：“抗菌素携带有大肠杆菌的致死基因，因此通过大肠杆菌霰弹法对它们进行测序是存在问题的。” 利用 29DNA聚合酶，从系统中剔除大肠杆菌，然后进行滚环扩增，这样就克服了上述问题。已经引起人们关注的另一个潜在应用就是一家名为454生命科学公司开发出的一种新测序技术。 在他们开发的“454测序”中，目标DNA被打断成碎片后固定下来，接着通过PCR方法进行扩增，然后被测序，整个过程不存在克隆问题。这样以来，就导致了大量“短片段阅读”的发生，而这些片段很难被完整拼接。虽然利用传统的测序方法可完成这些拼接工作，但是，对DNA片段进行必要的初步克隆工作，仍然是该过程中的一个瓶颈问题；如果你需要对一个基因组序列进行快速测定，将无细胞测序法与“454数据”联合起来应用就会加速实验进度。在Hutchison看来，“454生命科学公司正在开发其它方法，因而有可能使得这一应用的重要性大大降低，但我个人认为，这一方法仍然是非常有价值的。” 注：夏雨译自2006年1月号的《自然-方法学》，版权为英国NPG出版集团所有。更多信息请访问：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods |
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