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大孔树脂的预处理 将新大孔树脂于95% 乙醇溶液中浸洗8 h 后, 用蒸馏水清洗至无醇味, 再用5% 氢氧化钠浸泡4 h, 用蒸馏水洗至pH 值中性后, 接着用5% 盐酸浸泡4 h, 再用蒸馏水洗至pH 中性。湿法装柱, 一次完成, 自然沉降。 大孔树脂堆积密度的测定 取一标准玻璃层析柱(26 mm ×500 mm ) 将湿大孔树脂堆至100 mL , 取出, 称重。按下式计算大孔树脂的堆积密度: Q= m/v 式中 m —— 湿树脂质量, g; v —— 树脂体积,mL ;Q—— 堆积密度, g/mL。 饱和吸附量的测定 称取1. 000 g 湿树脂于锥形瓶中, 加入50 mL 0. 8mg/m L 的罗汉果皂甙水提取物, 封口, 于室温下震荡吸附24 h。分别于吸附前后测定溶液中罗汉果皂甙的浓度, 按下式计算饱和吸附量: Q 0 = (C0 - C1) ×V/W 式中 Q 0—— 饱和吸附量,mg/g; C0—— 吸附前浓度,mgömL ; C1—— 吸附后浓度,mg/mL ; V —— 溶液体积,mL ; W —— 大孔树脂湿重, g。 罗汉果皂甙静态吸附试验 称取1. 000 g 湿大孔树脂置于锥形瓶中, 加入50mL 0. 8 m gömL 的罗汉果皂甙水提取物, 封口, 每隔20m in 从上清液中取样0. 5 mL , 测定其吸光度, 然后按下式计算吸附量: Q = (C0 - C1) ×V/W 以吸附量为纵坐标, 作用时间为横坐标绘制静态吸附曲线。 罗汉果皂甙静态解吸试验 称取0. 500 g 湿大孔树脂3 份, 各加入15 mL 0. 8m gömL 的罗汉果皂甙提取物水溶液, 于室温下吸附24h 后, 将充分吸附了罗汉果皂甙水溶液的树脂进行过滤, 去除水液, 再将其置于锥形瓶中, 各加入15mL 95%乙醇溶液, 封口, 分别于20℃, 40℃, 60℃下进行解吸, 每隔3 m in 测定解吸液中罗汉果皂甙的浓度, 并绘制解吸曲线, 同时根据吸附量计算解吸率。 罗汉果皂甙的动态吸附试验 准确吸取20 mL (约17. 93 g)D101 大孔树脂装柱,以浓度为4 m göm L 的罗汉果皂甙水提取物溶液上柱,流速2 mL /m in, 分部收集流出液, 定时测定流出液中的罗汉果皂甙浓度, 然后以洗脱液体积为横坐标, 流出液中罗汉果皂甙含量为纵坐标绘制动态吸附曲线。吸附达到饱和后, 计算饱和动态吸附量。 洗脱剂及其浓度的选择 取一定量的罗汉果皂甙提取物水溶液, 上柱, 先用蒸馏水洗脱至无色后, 依次用50mL 10%～ 80% 浓度的乙醇溶液进行洗脱, 收集不同浓度的乙醇洗脱液并定容至50 mL , 取其中3 mL 洗脱液稀释至10 mL 后测定其罗汉果皂甙的浓度, 以确定最佳的洗脱剂浓度。 上样液最适pH 值的选择 将罗汉果皂甙水提物溶液(pH 值6. 0) 用氢氧化钠溶液调至不同的pH 值, 上柱, 依次用50 mL 同样pH 值的水溶液, 蒸馏水及60% 的乙醇水溶液进行洗脱, 收集60% 的乙醇洗脱液(pH 值6.0) , 定容至50mL , 取3mL洗脱液稀释至10 mL , 测定罗汉果皂甙的浓度, 确定其最佳pH 值。 罗汉果皂甙V , 11-O -罗汉果皂甙V 及罗汉果皂甙IV 的高效液相分析 对照品溶液的配制: 准确称取罗汉果皂甙V , 11-O-罗汉果皂甙V 及罗汉果皂甙IV 对照品0. 005 g, 用23%乙腈水溶液溶解并定容至10 mL , 配制成混合对照品溶液。 样品溶液的配制: 准确称取各样品0. 010 g, 用23%乙腈溶解并定容至10mL , 配制成1. 0m göm L 的样品溶液。 色谱条件: Hypersil ODS C18 柱(250 mm ×4. 6mm , 5μm, 大连伊利特科学仪器公司) ; 流动相: 乙腈:水= 23∶77 (v/v) ; 流速: 0. 5 mL /m in; 柱温: 30℃; 检测波长: 210 nm; 进样量: 10. 0μL。以保留时间定性, 根据峰面积计算样品的含量。 结果与分析 树脂的吸附特性 通过对大孔树脂D 101,D 3520,D 2400,N K-9 的初步筛选发现, 大孔树脂D 101对罗汉果皂甙的吸附、解吸效果较好, 因此本实验以大孔树脂D 101为柱材料, 研究其对罗汉果皂甙的分离纯化效果。结果表明, 大孔树脂D 101的堆积密度为0. 8965 g/m L。对罗汉果皂甙的饱和吸附量为25. 45m g/g , 饱和吸附率为82. 23% , 40℃时的平衡解吸率为87. 73%。 罗汉果皂甙的静态吸附曲线 由图1 可知, 随着时间的递增, 大孔树脂D 101对罗汉果皂甙的吸附量也相应提高。且在120m in 内吸附基本达到饱和, 说明大孔树脂D 101可对罗汉果皂甙进行富集与纯化。 罗汉果皂甙的静态解吸曲线 大孔树脂D 101对罗汉果皂甙的静态解吸作用见图2。结果表明, 温度影响罗汉果皂甙的解吸平衡, 温度越高, 解吸平衡所需时间越短, 解吸越快。但当温度较高时, 不易进行工艺操作, 综合有关因素, 选用40℃时进行洗脱, 利于工业化大规模制备。 罗汉果皂甙的动态吸附曲线 由图3 可知,D 101大孔树脂对罗汉果皂甙有良好的动态吸附性能, 在较长时间内保持低浓度泄漏。直到洗脱液到30 mL 时, 流出液中罗汉果皂甙的浓度才达0. 036 m g/m L 左右。但是, 此时泄漏速度开始快速增加, 当洗脱液体积到达105 mL 时, 已达到吸附平衡, 此时大孔树脂的饱和动态吸附量为21 m göm L。 洗脱剂浓度的选择 树脂吸附罗汉果皂甙后, 可选用对罗汉果皂甙溶解度较高的溶剂如甲醇、乙醇作洗脱剂。考虑到工业生产时, 甲醇的毒性较大, 因此选用乙醇作为解吸剂。图4 即为依次采用不同浓度乙醇溶液对罗汉果皂甙的洗脱效果图。结果表明, 10%～ 30% 的乙醇水溶液对罗汉果皂甙的洗脱能力较差, 洗脱液中皂甙的含量很少; 当乙醇浓度增至为40% 时, 随乙醇浓度的升高, 洗脱液中皂甙的含量逐渐增大, 以60% 乙醇洗脱液中皂甙的含量最高。随后, 再用70% 及80% 的乙醇溶液进行洗脱, 洗脱液中皂甙含量较少, 表明采用60% 的乙醇洗脱液便可将大部分的罗汉果皂甙解吸。因此, 优选的洗脱条件为: 在洗脱过程中, 先用蒸馏水及30% 乙醇水溶液进行洗脱以去除杂质, 再用对罗汉果皂甙洗脱能力最佳的60% 乙醇水溶液进行洗脱, 收集60% 乙醇洗脱液。 上样液pH 值对柱分离效果的影响 在罗汉果皂甙的分离纯化中, 最难去除的是色素类杂质。图5 表明, pH 值呈碱性时, 大孔树脂对罗汉果皂甙的分离纯化效果较好, 且色素吸附少, 有明显的脱色效果, 其中以pH 值9. 0 时的分离效果最佳。是由于在一定碱性条件下, 罗汉果皂甙比较稳定, 以分子形式存在, 而色素类等杂质以离子形式存在, 同时由于大孔吸附树脂只对分子态物质有吸附, 对离子态的物质无吸附, 从而使罗汉果皂甙得以富集、纯化。 高含量罗汉果皂甙提取物的制备及分析 综上所述, 罗汉果皂甙分离的最佳条件为: 上样液的pH 值为9. 0, 依次用pH 值9. 0 的氢氧化钠水溶液、蒸馏水、30% 的乙醇溶液及60% 的乙醇溶液进行洗脱, 收集60% 乙醇洗脱液, 浓缩并冷冻干燥, 可得高含量罗汉果皂甙提取物(M G I)。其主要成分的分析结果见表1。罗汉果皂甙V , 11-O-罗汉果皂甙V 及罗汉果皂甙IV 为罗汉果中主要的皂甙成分, HPLC 的分析结果表明, 经柱层析分离制备的罗汉果皂甙提取物(M G I)中这三种皂甙成分的含量均高于分离前的罗汉果皂甙水提物(M GC) , 三种皂甙成分的总含量达85. 70% , 尤其是罗汉果皂甙V 的含量达到69. 24% , 比分离前罗汉果皂甙V 的含量提高了41. 12% , 表明此方法可有效的分离纯化罗汉果皂甙, 显著提高提取物中罗汉果皂甙的含量。 结 论 本研究表明, 大孔树脂D101 对罗汉果皂甙具有吸附快、解吸率高及洗脱率高等特点, 且再生简便, 可较好的分离、纯化罗汉果中的罗汉果皂甙。最佳分离条件为:上样液pH 值9. 0, 在40℃条件下依次采用pH 值9. 0 的氢氧化钠水溶液、蒸馏水、30% 乙醇及60% 乙醇进行洗脱, 收集60% 乙醇洗脱液, 浓缩并冷冻干燥。与常用的树脂分离方法相比, 本文建立的工艺通过改变上样液的pH 值及乙醇的洗脱浓度和条件, 便可显著提高提取物中罗汉果皂甙V 等主要皂甙成分的含量。同时, 为工业化生产提供了简单、快速的分离纯化方法。 作者:戚向阳, 张俐勤, 陈维军, 宋云飞, 潘思轶 |
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