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近年来，为了克服生物大分子（蛋白、多肽类）药物半衰期短、稳定性差及 口服难以吸收的缺点，药学工作者把目光聚集在该类药物长效制剂的开发上。目 前，用聚乳酸类生物可降解聚合物，将生物大分子药物包被成微球，通过肌注或 皮下给药，使药物在体内缓慢释放已成为开发此类药物长效剂型的一个重要发展 方向。除了亮丙瑞林、重组人生长激素的微球制剂已被批准上市外，有多种 蛋白、多肽类药物的缓释微球正处于研究阶段。多数微球呈典型的三相释放特性， 即突释相、时滞相和缓释相，而为了达到一定的疗效,通常需要药物能够从微球 中缓慢而又连续的释放，以维持血药浓度在治疗窗内，因此如何减少突释，消除 不释放期一直是生物大分子（蛋白、多肽类）药物微球制剂的研究重点之一。本 文广泛集纳了国内外此领域的研究进展，从聚合物、药物、制备工艺和附加剂四 个方面介绍了影响蛋白、多肽类药物从微球中释放的因素，论述详尽，材料丰富， 相信会给读者带来收获。 ——编者按 ■聚合物的降解速度直接影响药物释放 聚乳酸类高分子材料包括聚乳酸（PLA）和聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物（ PLGA），因其具有良好的生物相容性及安全性，已被美国食品药品管理局（FDA ）批准为可注射用高分子材料。研究已经证明，应用些材料包被生物大分子药 物较传统治疗途径有许多优势，例如能够缓慢释放活性物质，具有靶向作用，延 长药物的半衰期，增加体内生物利用度等。 微球中的药物释放通过两种机制，即扩散机制和降解机制：前者是溶液经微 球的孔隙进入微球内部，溶解药物后扩散到释放介质中，微球表面附着的药物溶 解及扩散是造成突释效应的主要因素；后者是随着聚合物的降解，微球的骨架逐 渐溶蚀，使药物释放出来，此过程有药物的溶解及扩散。由此可以看出，聚合物 的降解特性直接影响药物的释放。 PLA及PLGA是以乙交酯和丙交酯为单体缩聚而成的，其降解过程有4步：水合 作用，初级降解，次级降解及溶蚀作用。水性介质首先渗透到聚合物内部，使得 聚合物的结构变得松散，玻璃化温度（Tg）降低；初级降解主要是聚合物的水合 部位水解，使得聚合物的相对分子质量逐渐减小，机械强度下降；在次级降解阶 段,聚合物的链状结构遭到破坏；在最后阶段聚合物片断进一步水解为可溶性的 分子。聚乳酸类材料的降解速率：PLGA（DL）＞PLA（DL）＞PLA（L）。目前的 研究证明，聚合物的组成（乙交酯与丙交酯的比例）和聚合物的结构及相对分子 质量都是影响聚合物降解的因素。 ◆丙交酯比例减小聚合物降解加快 对一系列不同相对分子质量及不同组成的PL鄄GA所做的体外释放实验证明， 具有相同相对分子质量而组成不同的PLGA随着分子中丙交酯比例的减小，降解速 率加快，PLGA（50∶50）的降解速率最快。由于丙交酯分子中甲基的存在阻碍了 酯键的水解，降低了聚合物的亲水性，其降解速率变慢。由于乙交酯的亲水性高， PLGA中乙交酯比率较大时，聚合物的降解速度快，但当乙交酯的含量大于50%时， 聚合物的油溶性变差，不溶于大多数有机溶剂，无法用于制备微球。 研究证明，醋酸亮丙瑞林缓释微球在使用相对分子质量为14000的PLGA（75 ∶15）为微球基质时，皮下注射后药物可持续释放1个月；当使用相对分子质量 为15000的PLA为微球基质时，药物可在体内持续释放达3个月。而体外的实验则 发现，超氧化物歧化酶（SOD）PLA微球中的SOD，53天后累积释放不到20%；而它 的PLGA（50∶50）微球中的SOD在53天后完全释放。 ◆相对分子量与降解速度成反比 如果单纯从材料本身考虑，聚合物的相对分子质量越大，分子结构排列越整 齐，生物降解速度越慢，这已被众多的研究证明。 国外学者研究了抗可卡因接触反应抗体（15A10）的PLGA微球，实验选用了 两种不同相对分子质量的PLGA（50∶50），体外释放表明，采用高相对分子质量 （100000）PLGA（50∶50）制备的微球，抗体在10天内的累积释放不到5%；而采 用低相对分子质量（10000）的聚合物可明显改善抗体的释放特性，累积释放可 达15%。还有研究发现，使用相对分子质量为12000的PLGA（50∶50）制备的降钙 素微球其体内外释放速度均快于相对分子质量为30000的PLGA（50∶50）微球。 为了改变微球的释放性质，常使用不同相对分子质量的PLGA的混合物制备微 球。研究人员制备了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-GSF）的PLGA微球，体 外释放实验表明，高相对分子质量（40400）的PLGA（50∶50）微球在1周内几乎 不释放，而采用相对分子质量为40400，22300的PLGA（50∶50）和相对分子质量 为6100的PLA（三者的比例为60∶20∶20）制备的微球可以持续释药两周，几乎 没有突释效应。 ◆加入亲水基后水解加速 为了改变聚合物的释放特性，使药物释放过程易于控制，常在聚合物结构中 引入亲水性官能团，如羟基、羧基或PEG。这些亲水性基团的引入可以明显地改 变聚合物的生物降解性质，增强聚合物的水合作用，加速水解过程。 研究发现，采用不同结构的PLGA制备的微球中重组人胰岛素样生长因子Ⅰ（ rhIGF-Ⅰ）的释放有显著性差异。研究人员观察了两种PLGA（50∶50），Resom- er RG502和Resomer RG502H，相对分子质量均为12000，他们发现以RG502制备的 微球rhIGF-Ⅰ24小时内的突释达48.8%，以后每天的释放率小于1%；而以RG502H 制备的微球rhIGF-Ⅰ24小时内的突释只有25.8%，每天的释放率可达3.5%。RG502 的分子是烷基末端，而RG502H则是羧基末端，RG502H显示出了更好的释放特性， 也就是说聚合物亲水性的差异造成了微球释放特性的不同。由于烷基末端的存在， RG502在有机溶剂中溶解性能好，在微球制备过程中蛋白颗粒易迁移到微球表面， 造成了很高的突释效应，然而由于RG502的亲水性差，在释放过程中水分摄取率 低，微球骨架降解缓慢，造成rhIGF-Ⅰ释放缓慢。而RG502H则是因其亲水性高， 生物降解速度快，rhIGF-Ⅰ可以持续释放并在30天内释放完全。研究人员制备了 rhGH的PLGA微球，对比后发现，同相对分子质量羧基末端的PLGA微球体外降解比 烷基末端的快2～3倍，体内降解速度快3～4倍。 研究人员制备了一系列REG与PLGA（50∶50）的共聚物（PEG-PLGA），分别 以PLGA和PEG-PLGA为微球基质研究了促性腺激素释放激素拮抗剂Teverelix微球 的释放特性。体外释放实验表明，载药量为8%的PLGA微球在15天内几乎不释放， 而PEG-PLGA微球的释药量可达15%；载药量为25%的PLGA微球在15天内可释放30%， 而PEG-PLGA微球的释药量可达60%。 ◆蛋白吸附导致药物释放不完全 高分子材料的疏水性可能引起蛋白吸附，从而导致蛋白质的聚集及从PLGA微 球中体外释放不完全。 研究表明，由于溶菌酶与PLGA链末端羧基的静电相互作用，溶菌酶经历了非 特异性吸附和非共价聚集，从而导致溶菌酶从PLGA微球中不释放。国外学者也发 现破伤风毒素在体外的不完全释放的部分原因是由于PLGA和玻璃瓶对破伤风毒素 的吸附作用。他们将破伤风毒素与牛血清白蛋白（BSA）一起包被，可使其在体 外释放更完全，在释放介质中加入BSA可显著减少聚合物和玻璃器壁对破伤风毒 素的吸附。实验证明，rhIGF-Ⅰ可与PLGA的羧基末端结合，能够显著减少突释。 ■药物载量和稳定性值得关注 近年来的研究证明，不但聚乳酸类聚合物本身的性质直接或间接地影响药物 释放，微球所包被的多肽类药物量的多少，以及药物本身的稳定性也会影响药物 的释放。 ◆药物不稳定延缓释放 生物大分子药物的稳定性差，在微球的制备过程中，温度、剪切力及油水界 面等都会影响药物的稳定性，特别在释放过程中，蛋白类药物极易在微球内部聚 集成为不溶性沉淀而影响药物的释放。 研究者发现，无论采用复乳化-溶剂蒸发法（W/O/W）还是乳化-溶剂蒸发法 （S/O/W），使用高相对分子质量的PLGA（Resomer RG504）或低相对分子质量的 PLA（Resomer L104）制备的胰岛素微球，体外释放均缓慢且不完全，30天内的 累积释放皆小于30%。他们对未释放的药物进行分析发现，仅有11%的胰岛素保持 了其完整性，22%形成了二聚体，超过50%形成了多聚体。现在已知道，聚合物水 解致使微球内部pH值降低是造成药物不稳定的主要原因。为了克服这种不利的酸 性环境，研究人员在PLGA基质中尝试加入了难溶性的弱碱，如Mg(OH)2，ZnCO3等， 成功地稳定了基质中的BSA，显著促进了BSA的释放。 ◆载药量越高突释量越大 微球的载药量高则突释大，累积释放相应较多，这是因为载药量高则药物易 在微球表面富集，在释放时形成水溶性通道可加速药物的释放，同时微球内外较 高的浓度梯度促使微球内部的药物向外扩散。 对FITG-albumin的PLGA（Resomer RG503H）微球进行的荧光实验表明，载药 量为7%的微球，FITC-albumin均匀分布在微球内部；载药量为30%的微球，蛋白 集中分布在微球的外层区域，10天内的累积释放分别为20%和70%。对不同载药量 的rhIGF-ⅠPLGA（Resomer RG502H）微球的体内、外释放行为的研究证明，载药 量为20%的微球突释及累积释放都显著高于载药量为4%的微球。 ■附加剂对药物释放的影响需深入研究 在微球的制备过程中，常常要加入多种附加剂来保持蛋白、多肽类药物的稳 定性、提高包封率或便于成球等。常用的附加剂有多元醇类（如甘露醇、海藻糖、 山梨醇等），非离子表面活性剂（如聚山梨酯20，Span-80，F-68等），大分子 化合物［人血清蛋白（HSA），聚乙二醇（PEG），羟醛-β-环糊精（HP-β-CD） ］等，这些物质都可能影响微球的释放特性。但从目前来看，其对药物释放影响 的机制尚不十分明了，有待深入研究。 研究显示，非离子表面活性剂的加入可以增加微球的亲水性，有助于药物的 释放。国外研究人员研究了表面活性剂对降钙素（CT）的PLGA微球体内释放行为 的影响，在内水相加入聚山梨酯80或油相加入Span-60。体内试验表明，未加入 表面活性剂的微球突释后的释放率为每天0.66%，出现了较长时间的时滞期；含 有表面活性剂的微球可持续释放达7周，后继释放率为每天1.33%，由于表面活性 剂可以稳定初乳使多肽均匀地分布在微球的骨架中，同时防止聚合物对CT的吸附， 有利于释放。 另外一项研究显示，在制备胰岛素（Insulin）PLGA（Resomer RG504H）微 球过程中，形成初乳时分别加入不同质量浓度（15或30毫摩尔/升）的3种非离子 表面活性剂聚山梨酯-20，Span-80和F-68，体外试验表明，含有表面活性剂的微 球突释效应都不同程度的高于不含表面活性剂的微球，胰岛素的后续释放率都增 大，可能是这些亲水性的非离子表面活性剂增加了微球的亲水性，促进了胰岛素 的释放，实验证明，加入3%的聚山梨酯-20可以得到包封率较高，释放较理想的 微球。研究还发现，使用W/O/W法制备BSA的PLGA（50∶50）微球时，在聚合物相 加入1%的Poloxamer 188或Poloxamer 331可显著增大突释效应，蛋白的持续释放 率也明显增加，但对W/O/O法制备微球的影响不大。 ■选准微球制备工艺 促进药物平稳释放 制备微球有多种工艺，而不同的制备工艺会直接影响药物在基质内的分布及 稳定性、微球的表面形态和大小及微球的内部结构，从而间接影响药物的释放程 度。所以，根据不同的大分子药物种类，可以选择不同的微球制备工艺，达到控 制药物均匀平稳释放的目的。对此，国内外研究者做了大量的研究工作。 ◆复乳法 复乳法技术路线简单易行，但工艺中的影响因素很多，包括内水相体积、油 相体积、内水相和油相的比例，制备初乳和复乳的搅拌条件，蛋白、多肽的浓度， 搅拌装置等，造成药物释放难以控制。其中，比较受重视的是复乳法对蛋白、多 肽类药物的稳定性及微球结构的作用对突释和释放的影响。 在复乳法制备初乳时，由于蛋白质具有表面活性易于吸附在油水界面上，发 生不可逆的聚集，造成释放不完全。对比BSA、卵清蛋白和溶菌酶在油水界面的 聚集情况的研究证明，BSA在油水界面较为稳定。使用复乳法制备溶菌酶PLGA微 球的研究者证明，溶菌酶的聚集现象可造成微球中药物释放不完全。研究人员还 利用复乳法制备了α-糜蛋白酶的PLGA（50∶50）微球，发现制备过程中约35%的 蛋白发生了非共价性聚集，40天的累积释放只有65%，选择PEG5000作为稳定剂可 将非共价性聚集减少到7%，40天的累积释放可达到90%。PEG5000同样可以稳定溶 菌酶，促使PLGA微球中的溶菌酶释放完全。 在复乳法制备PLGA微球时，改变工艺可得到不同结构的PLGA微球，而微球的 结构会对释放造成较大的影响。国外研究人员制备了生长激素抑制素的PLA（Re- somer R202）微球，内外水相的缓冲系统会显著影响微球的结构，当不存在缓冲 系统时，微球的构造致密无孔洞，而内水相采用0.1毫摩尔/升的枸橼酸缓冲液时 （pH值=2.2），微球结构松散呈大量孔洞，释放液易渗透到微球内部，可明显促 进释放，前者1周内的累积释放不到10%而后者可达60%。内外水相的渗透压差促 使外水相的水分流入内水相，形成了微球的多孔结构。实验还发现当内水相含有 无机盐（NaCl或CaCl2）时，得到表面多孔的微球，微球的突释高达65%。利用复 乳法制备的神经生长因子（NGF）PLGA微球，内部结构呈蜂窝状，外水相加入100 克/升的NaCl可促使微球的结构紧凑，显著减小突释。据报道，提高外水相的渗 透压同样可以降低BSA的突释效应。 ◆部分无水法 为了克服复乳法制备工艺中油水界面的不利影响，近年来有许多新工艺的研 究报道。部分无水法就是，即直接将蛋白或多肽的粉末混悬在溶有聚合物的 有机溶剂中，经过一步乳化制备微球，此工艺可以保证药物在制备过程中的稳定 性，但突释很大。为了减少突释，研究人员在油相中加入适量的乙醇或甘油同时 又在油相中加入氧化锌，水相中加入醋酸锌，可显著地降低胰岛素PLGA微球的突 释效应，将体内突释由78%减小至10%。使用PLGA和PLA的混合质制备的牛超氧化 物歧化酶（bSOD）的微球，其蛋白质首先被油相中亲水性强的PLA所包裹，微球 外层是亲水性差但量多的PLA，这样不但可以提高包封率还可减少蛋白在微球表 面富集，突释只有2.3%。蛋白及多肽的颗粒大小会影响微球的释放行为，研究人 员将重组人生长激素（rhGH）于不同比例的醋酸铵共溶后冷冻干燥得到粒径大小 不同的蛋白颗粒，体内实验证明，rhGH颗粒的粒径减小，所制备的微球突释作用 也小。 ◆完全无水法 完全无水法是将蛋白或多肽的颗粒分散在溶有聚合物的有机溶剂中，在另一 含有乳化剂的油溶液中乳化，最后固化形成微球。此法完全避免了使用水性溶媒， 对水溶性生物大分子药物包封率很高，有利于制备工艺中药物活性的保持，它同 样存在突释放效应很大的缺点。 研究人员使用该工艺制备了破伤风类毒素（TT）的PLGA（Resomer R506）微 球，体内实验表明，微球1天的突释达56%，后继释放缓慢，1周后未见TT释放， 以Poloxamer 188(Pluronic F-68)与PLGA不同比例（1∶10，3∶10，5∶10）的混 合基质制备微球，随着基质中F-68的增多突释作用减小至10%，同时可促进TT的后 续释放，可能是由于F-68的存在使得TT均匀地分布在微球的骨架中，减少了TT在 微球表面的富集。 ◆低温喷雾提取法 利用复乳法制备的rhGHPLGA微球的突释较高（35%左右），但持续释放和活 性的保持较好，然而体内试验证明，微球突释后存在达2周的时滞期。为此，研 究人员采用了另外新的制备工艺——低温喷雾提取法，即将蛋白质粉末悬浮在 溶有PLGA的有机溶剂中，通过喷雾的方法形成小液滴，在液氮中冷冻，用一低温 有机共溶剂（例如乙醇）抽提溶解聚合物的有机溶剂而得到微球。这种方法已被 成功的用于开发rhGH微球，并已被FDA批准上市。此工艺还成功用于rhIGF-I，血 管内皮生长因子（rhVEGF）以及神经生长因子（rhNGF）。它主要利用Zn2+和蛋 白质形成复合物，一方面有助于蛋白的稳定，防止蛋白在微球内部形成多聚体而 无法释放，另一方面此复合物为可溶性沉淀，可缓慢溶解于释放介质中减小突释， 在聚合物相加入适量的ZnCO3可进一步降低突释，应用此技术制备的rhNGF的PLGA 微球突释仅1%，ZnCO3的作用可能是提供Zn2+来源并减少释放过程中微球内部的 水溶性通道。 ◆喷雾干燥法 喷雾干燥工艺过程简单，通常一步成球，无需对微球进行后处理（如清洗、 收集、干燥），适合较大规模的微球制备。使用喷雾干燥法制备重组人红细胞生 成素（rhEPO）的PLGA微球，体外实验突释达15%，当聚合物加入5%的PLA时可减少 突释至7.5%，但突释后由于rhEPO在微球内部聚集形成不溶性沉淀，几乎未见释放。 还有学者发现，使用喷雾干燥法制备的伐普肽（vapreotide）的PLGA（Resomer RG502H）微球体外突释达42%，此后4周内连续释放约40%的多肽，使用PLA（Reso- mer R202H）和PLGA等比例混合作为微球的基质可降低突释至5%，对后续的释放行 为无明显影响，体内试验则比前者表现出更长的缓释作用。 □尹东锋 钟延强 |
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