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标题
维生素D测定法
附录序号
附录Ⅶ
内容全文
K. 维生素D测定法 本法系用高效液相色谱法(附录Ⅴ D)测定维生素D(包括维生素D<[2]>和D<[3]>,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量,以单位表示,每单位相当于维生素D0.025μg。 测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定,否则应按第二法处理后测 定;如果按第二法处理后,前维生素D峰仍受杂质干扰,仅有维生素D峰可以分离时,则应按第三法测定。 第一法 对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D<[2]>或D<[3]>对照品25mg,置100ml棕色量瓶中,加异辛烷80ml,避免加热,用超声处理助溶1分钟使完全溶解,加异辛烷至刻度,摇匀,充氮密塞,避光,0℃以下保存。 测定维生素D<[2]>时,应另取维生素D<[3]>对照品25mg,同法制成维生素D<[3]>对照品贮备溶液,供系统适用性试验用。 内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯25mg,置25ml量瓶中,加正己烷至刻度,摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂,正己烷-正戊醇(997∶3)为流动相,检测波长为254nm。量取维生素D<[3]>对照品贮备溶液5ml,置具塞玻璃容器中,通氮后密塞,置90℃水浴中加热1小时,取出迅速冷却,加正己烷5ml, 摇匀,置1cm具塞石英吸收池中,在2支8W主波长分别为254和365nm的紫外光灯下, 将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5~6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D<[3]>、反式维生素D<[3]>、维生素D<[3]>和速甾醇D<[3]>;取此溶液注入液相色谱仪,测定维生素D<[3]>的峰值,先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0%;前维生素D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为0.5)与反式维生素D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为 0.6)以及维生素D<[3]>与速甾醇D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。 校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中,加正己烷至刻度,摇匀;取一定量注入液相色谱仪,计算维生素D的校正因子f<[1]>。 另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中,加入2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后,密塞,置90℃水浴中加热1.5小时,取出迅速冷却至室温,精密加内标溶液5ml,加正己烷至刻度,摇匀;取一定量注入液相色谱仪,计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f<[2]>。 f<[2]>=(A<[s]>·m<[r]>-f<[1]>m<[s]>A<[r1]>)/A<[r2]>·m<[s]> 式中 A<[s]>为内标的峰值; m<[r]>为加入对照品的量; f<[1]>为维生素D的校正因子; m<[s]>为加入内标物质的量; A<[r1]>为维生素D的峰值; A<[r2]>为前维生素D的峰值。 含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。 mi=(f<[1]>·A<[i1]>+f<[2]>A<[i2]>)·m<[s]>/A<[s]> 式中 A<[i1]>为维生素D的峰值; A<[i2]>为前维生素D的峰值; m<[s]>为加入内标物质的量; A<[s]>为内标的峰值。 第二法 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上,重量不超过2.0g),置皂化瓶中,加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50%(g/g)氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g,则加50%(g/g)氢氧化钾溶液4ml],置水浴上加热回流30分钟,冷却后,自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁,将皂化液移至分液漏斗中,皂化瓶用水60~100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中,用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次,第一次60ml,以后每次40ml,合并乙醚液,用水洗涤数次,每次约100ml,洗涤时应缓缓旋动,避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色,静置,分取乙醚提取液,加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分,分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤,洗液与提取液合并,置具塞圆底烧瓶中,在水浴上低温蒸发至约5ml,再用氮气流吹干,迅速精密加入甲醇3ml,密塞,超声处理助溶后,移入离心管中,离心,取上清液作为供试品溶液A。 净化用色谱柱系统分离收集维生素D 精密量取上述供试品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱,以甲醇-乙腈-水(50∶50∶2) 为流动相进行分离,检测波长为254nm,从计录仪上观察色谱图,要求维生素D与前维生素D为叠 峰,并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开;准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液,置具塞圆底烧瓶中,用氮气流迅速吹干,精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于2ml,并使每1ml中含维生素D为50~140单位,内标物质与维生素D的重量比约为4∶1),密塞,超声处理助溶,即为供试品溶液B。 取供试品溶液B,按第一法进行含量测定,进样量为100~200μl。 第三法 供试品溶液的制备 取各该制剂项下制备的供试品溶液A,按上述第二法净化用色谱柱系统分离维生素D项下的方法处理,至“用氮气流迅速吹干”后, 加入异辛烷2ml溶解,通氮排除空气后,密塞,置90℃水浴中,加热1.5小时后,立即通氮在2分钟内吹干,迅速精密加入正己烷2ml,溶解后,即为供试品溶液C。 对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D 50单位,精密量取2ml置具塞圆底烧瓶中,照供试品溶液制备项下的方法,自“通氮排除空气后”起,依法操作,得对照品溶液。 含量测定 在上述第一法的色谱条件下,取对照品溶液与供试品溶液C,交替精密进样200μl,量取维生素D的峰值,按外标法计算含量。 |
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