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标题
抗生素微生物检定法
附录序号
附录Ⅺ
内容全文
A. 抗生素微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。 培养基及其制备方法 培养基Ｉ 胨 5g 琼脂 15～20g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 磷酸氢二钾 3g 除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅱ 胨 6g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 琼脂 15～20g 酵母浸出粉 6g 水 1000ml 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅲ 胨 5g 磷酸氢二钾 3.68g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸二氢钾 1.32g 酵母浸出粉 3g 葡萄糖 1g 氯化钠 3.5g 水 1000ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅳ 胨 10g 葡萄糖 10g 氯化钠 10g 琼脂 20～30g 枸橼酸钠 10g 水 1000ml 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅴ 胨 10g 琼脂 15～20g 麦芽糖 40g 水 1000ml 除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高 0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀， 调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 培养基Ⅵ 胨 8g 磷酸二氢钾 1g 牛肉浸出粉 3g 葡萄糖 2.5g 酵母浸出粉 5g 琼脂 15～20g 氯化钠 45g 水 1000ml 磷酸氢二钾 3.3g 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4,在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅶ 胨 5g 枸橼酸钠 10g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15～20g 磷酸氢二钾 7g 水 1000ml 磷酸二氢钾 3g 除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅷ 酵母浸出粉 1g 琼脂 15～20g 硫酸铵 1g 磷酸盐缓冲液(pH6.0) 1000ml 葡萄糖 5g 混合上述成分，加热溶化后滤过，在115℃灭菌30分钟。 营养琼脂培养基 胨 10g 琼脂 15～20g 氯化钠 5g 肉浸液 1000ml 除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为 7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。 灭菌缓冲液 磷酸盐缓冲液(pH6.0) 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 磷酸盐缓冲液(pH7.8) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 磷酸盐缓冲液(pH10.5) 取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液 取枯草芽孢杆菌［CMCC（B） 63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日,用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液 取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液 取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 大肠杆菌（Escherichia coli）悬液 取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液 取啤酒酵母菌（9763）的Ｖ号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。 标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。 供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，用各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。 双碟的制备 取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（照表 1）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀,在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。 检定法 二剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于4个,在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液,其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法（附录ⅩⅣ）中的（2.2 ）法进行可靠性测验及效价计算。 三剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于6个,在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度(S<[3]>)、中浓度(S<[2]>)及低浓度(S<[1]>)的标准品溶液，其余3个小管分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液;三种浓度的剂距为1∶0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径(或面积)，照生物检定统计法(附录ⅩⅣ)中的(3.3)法进行可靠性测验及效价计算。 本法计算所得效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时,则应调整其估计效价，予以重试。 除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％。 表1 抗生素微生物检定试验设计表
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│ │ 培 养 基 │ 灭菌 │抗生素浓度│ 培养条件
抗生素类别 │ 试 验 菌 ├───┬─────┤缓冲液│ 范 围 ├─────┬─────
│ │ 编 │ pH值 │pH值 │ │ 温 度│ 时 间
│ │ 号 │ │ │ 单位/ml │ ℃ │ 小 时
───────┼───────────────┼───┼─────┼───┼─────┼─────┼─────
链霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.6～1.6 │ 35～37 │ 14～16
卡那霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16
阿米卡星 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16
巴龙霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16
核糖霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 2.0～12.0│ 35～37 │ 14～16
卷曲霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │10.0～40.0│ 35～37 │ 14～16
磺苄西林 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 5.0～10.0│ 35～37 │ 14～16
去甲万古霉素│枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅷ │ 6.0 │ 6.0 │ 9.0～43.7│ 35～37 │ 14～16
头孢噻肟钠 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅶ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 0.5～2.2 │ 35～37 │ 14～16
庆大霉素 │短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63202] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 2.0～12.0│ 35～37 │ 14～16
红霉素 │短小芽孢杆菌[CMCC(B) 63202] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 5.0～20.0│ 35～37 │ 14～16
新霉素 │金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003] │ Ⅱ │ 7.8～8.0 │ 7.8②│ 4.0～25.0│ 35～37 │ 14～16
四环素 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18
土霉素 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18
美他环素 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18
金霉素 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 4.0～25.0│ 35～37 │ 16～18
多西环素 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 4.0～25.0│ 35～37 │ 16～18
氯霉素 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │30.0～80.0│ 35～37 │ 16～18
杆菌肽 │藤黄微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 2.0～12.0│ 35～37 │ 16～18
粘菌素 │大肠杆菌[CMCC(B) 44103] │ Ⅵ │ 7.2～7.4 │ 6.0 │ 614～2344│ 35～37 │ 16～18
两性霉素B ①│啤酒酵母菌 (9763) │ Ⅳ │ 6.0～6.2 │10.5 │ 0.5～2.0 │ 35～37 │ 24～36
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① 两性霉素B双碟的制备，用菌层15ml代替两层。
② 含3％氯化钠。
表2 抗生素标准品品种与理论值
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┃ 标准品品种 │ 标准品分子式或品名 │理论计算值 u/mg ┃
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┃链霉素 │(C21H39N7O12)2·3H2SO4 │ 798 ┃
┃卡那霉素 │C18H36N4O11·H2SO4 │ 831.6 ┃
┃阿米卡星 │C22H43N5O13 │ 1000 ┃
┃核糖霉素 │C17H34N4O10·nH2SO4(n<2) │ ┃
┃新霉素 │硫酸新霉素 │ ┃
┃庆大霉素 │硫酸庆大霉素 │ ┃
┃磺苄西林 │C16H16N2Na2O7S2 │ ┃
┃头胞噻肟钠 │C16H16N5NaO7S2 │ 951.85 ┃
┃四环素 │C22H24N2O8·HCl │ 1000 ┃
┃土霉素 │C22H24N2O9·2H2O │ 927 ┃
┃美他环素 │C22H22N2O8·HCl │ 923.86 ┃
┃金霉素 │C22H23ClN2O8·HCl │ 1000 ┃
┃多西环素 │C22H24N2O8HCl·1/2C2H5OH·1/2H2O│ 866.45 ┃
┃红霉素 │C37H67NO13 │ 1000 ┃
┃氯霉素 │C11H12Cl2N2O5 │ 1000 ┃
┃杆菌肽 │杆肽菌 │ ┃
┃粘菌素 │硫酸粘菌素 │ ┃
┃去甲万古霉素 │C65H73Cl2N9O24·HCl │ 975.23 ┃
┃卷曲霉素 │硫酸卷曲霉素 │ ┃
┃两性霉素B │C47H73NO17 │ 1000 ┃
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