生殖支原体检测方法的研究进展

　　自Tully[1]等1981年首次从非淋菌性尿道炎男性患者的尿道分泌物中分离培养出2株生殖原体（Mycoplasma genitalun,Mg）以后，许多学者对Mg的生长特性、免疫学特性、分子生物学特性以及与疾病的关系等进行了大量的研究并建立了多种Mg的检测方法，本文就Mg的检测方法研究进展进行简要综述。

　　1 分离培养法

　　1.1 培养基培养[1,2] Mg对培养基要求极高且生长缓慢,培养较难,尤其是临床标本中Mg的培养更不容易成功.Tully1981年建立了对医学支原体具有重要意义的SP-4培养基.适合于Mg生长的SP-4培养基,不含醋酸铊,含Mg代谢所需的葡萄糖及其它营养成份,最适pH为7.4-7.5,可通过加入0.8%Noble琼脂或0.50.6%琼脂而固体化,用于克隆菌株,观察菌落,Tully等利用这种培养基,从13份尿道分泌物标本中分离培养获得2株Mg,培养期约为50天.1996年Jensen等还报道了另一种适合Mg生长的培养基，即改良Friis肉汤培养基，11份PCR检测Mg-DNA阳性的尿道分泌物标本中，有6份在其中呈阳性生长。

　　国内学者对SP-4培养基进行了改良。赵季文等[4]利用改良的SP-4培基从性病及性乱人群中分离Mg获得成功，初代生长时间在30天以上，平均为37.83天，最长为55天。

　　1.2组织细胞培养法 组织细胞培养支原体，可为支原体提供良好的类似体内的生长环境。早在60年代，Chanock等[5]报道了肺炎支原体（Mp）在组织细胞中的生长。90年代，Jensen等[3，6]开始尝试用细胞培养法来进行Mg的繁殖，并借此在电镜下观察到Mg侵入细胞的过程以及在细胞内的定位。在PCR的监测下，Jensec发现在11分PCR检测MgDNA阳性的尿道标本中，有9份适应在Vero细胞磁头中增殖，经过多次传代培养后转入改良的Friis fF肉汤培养基中，有6份能继续传代生长，最终在琼脂培养基中克隆获得4株。Jensen认为，在分离获得新的Mg菌株方面，细胞培养繁殖过程起到了三方面的作用，一是使临床标本中的Mg逐渐适应在人工培养基中生长，二是增加了接种于支原体肉汤培养基中的支原体数量，三是提供持续的接种源。

　　2 血清学方法

　　根据Mg的免疫学特性，人们建立了用检测Mg抗体和检测与鉴定Mg抗原的血清学方法。

　　Furr等[7]于1984年详细报道了检测Mg抗体的MIF技术。Moller等对31例未检测出Ct和Mh血清抗体的急性盆腔炎患者，用MIF检测Mg抗体，发现其中大约40%在发病后一个月内抗体滴度有4倍或4倍以上的改变。Taylor-Robinson等[9]报道应用间接MIF检测NGU患者Mg抗体，认为间接MIF试验是一种具有足够敏感性、特异性和简便易行的检测方法。Jensen等曾用EIA检测有尿道炎症与无尿道炎症状的男性STD患者急性期血样标本中Mg抗体，结果发现反应性较弱，且与Mp存在广泛的交叉反应。

　　根据特异性抗体能阻止支原体的生长及代谢这一特性，可采用已知高价血涉及进行祖先生长及代谢抑制试验以鉴别支原体[11]。赵季文等曾采用MIT鉴定所分离获得的Mg菌株。

　　暴露于支原体表面的脂结合膜蛋白（lipid-associated membrane proteins,LAMPs是一种支原体种属特异性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原体，其LAMP抗体具有高度种属特异性，与其它种属无交叉反应[12，13]。）因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法检测Mg抗体，可消除Mg与Mp之间的交叉反应。

　　3 分子生物学方法

　　DNA探针和聚合酶链反应（PCR）检测Mg的方法，克服了前两类检测方法的弊端，为研究Mg与疾病的病因学关系提供了有力的手段。

　　3.1DNA探针技术 1987年Hyman[14]用PUCB载体构建成Mg基因文库，并从中筛选制备出特异性DNA探针，通过斑点杂交，可检测仅含0.1ng的特异性支原体DNA，即105CFU。

　　3.2 聚合酶链反应（PCR）技术 PCR是一种新的基因诊断技术，灵敏度高，特异性强，且快速、简便。1990年，PCR技术开始在医学支原领域应用。

　　早期的引物多参照菌体末端特异性粘附蛋白的DNA序列而设计。Palmer等体外扩增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列，3株Mg均出现37bp的DNA片断，并证明PCR技术可检测到10-15g的 mg-DNA，其引物序列的：

　　mg1:5'TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3'

　　mg2:5'CTG CTT TGG TCA AGA CAT CA3'

　　1991年Jensen等[16]根据Mg的粘附蛋白基因设计合成了如下组引物：

　　mgPa-1 5'AGA TGA TGA AAC CCT AAC CCC TTG G3'

　　mgPa-1 5'GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3'

　　mgPa-1 5'CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3'

　　用MgPa-1 和MgPa-3成功地扩增出Mg的281bpDNA片段，5个临床分离株扩增出同样的产生，而其他支原体和细菌均为阴性，用MgPa-2作探针，对扩增产物经Southern eP印迹杂交，均为阳性，证明引物具有特异性，共检出下降大约有50个Mg细胞。1993年Jensen等[17]又根据Mg粘膜蛋白基因设计了另一对引物，即：

　　mg粘附蛋白基因设计了另一对引物，即：

　　mgPa-476：5‘ATG GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3’

　　mgPa-903：5‘TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC TAA TGC3’

　　用来证实和补充引物MgPa-1和MgPa-3所扩增的结果，其扩增片段为453bp。研究发现，这两对Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用这种方法检测99例尿道炎病人的尿道拭子，结果17例Mg阳性，而用培养法无一例阳性。

　　1994年 Jensen[18]扩增Mg粘附蛋白基因序列并测序表明：该序列在Mg条件之间有明显异质性，为此，Jensen等学者根据原体属性高度保守区域16SrRNA的基因序列，设计了种特异性PCR引物，以期检测临床标本中所有Mg的感染：其引物序列为：

　　Mg-1，5‘GAA TGA CTC TAG CAG GCA ATG GCTG3’

　　Mg-2，5’ATT TGC TGC TCA CTT TTA CAA GTT GGCT3‘

　　4种临床标本的实验结果表明，Mg粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN基因序列则是100%同源，将两种引物PCR结合，还可在可疑阳性标本中检测出10-50个Mg基因拷贝以下的Mg基因，即以16SrRNA基因为靶基因的PCR系统在保证长期特异性基础上更为灵敏。

　　赵季文等[19]采用Palmer设计的引物，扩增 mg37bpDNA片段，检测三种人群的Mg，结果是性乱人群阳性率为25.26%，性病人群为12.33%，而健康人群为3.85%。孔繁荣等[20]采用Jensen设计的MgPa-1和MgPa-3，扩增Mg281bpDNA片段，检测结果是性乱妇女Mg检出率为10.2%，STD患者为4.0%。

　　1998年，糜祖煌等[2]研究报道了分别以Mg粘附蛋白和16rRNA基因为靶基因建立的二种套式PCR检测技术，前者扩增生Mg的374bpDNA片段，后者扩增产生241bpDNA片段。套式PCR不仅提高了灵敏度，而且因采用两对不同的引物，特性也进一步的得到提高。用这些法检测40例女性STD患者，发现Mg阳性12例，阳性率30%，检出阳性率均高于普通PCR法。

　　4 小结

　　微生物感染诊断的“金标准”是培养法，然而Mg培养成功率极低，有待于对培养基进行进一步的研究和改良，以促进Mg在其中的生长；此外，将细胞株引入Mg的培养可能是一个较好的方法，有必要加强这方面的探索和研究。免疫学检测方法因支原体种属间易出现交叉反应以及对抗原、抗体纯度要求较高而在实际应用上受到一定限制，若能研究建立快速、灵敏、特异的检测临床标本中Mg抗原的方法，则具有较大的实用价值。PCR技术是一个简单而又直接的检测Mg方法，正被日益广泛地采用，主要用于Mg感染的早期诊断或急性感染的诊断及各种人群中Mg的流行病学研究。但在应用时应注意：①临床标本中Mg含量低，DNA纯度不够，抑制物过多，TaqDNA聚合酶活性低均会引起假阴性，应进一步完善模板DNA的提取技术；②因PCR灵敏度极高，在整个操作过程中均应严格避免PCR产物的污染，以减少假阳性。

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