应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价

　　应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干 /祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及 APBSC中的CD34+细胞，本文比较了几种 FACS检测CD34+细胞方法的异同。

　　1　材料与方法

　　1.1　外周血造血干细胞　APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。

　　1.2　CD34+细胞的标记　对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。

　　1.2.1　溶血法　 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。

　　1.2.2　 分离单个核细胞法　经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。

　　1.3　FACS检测CD34+细胞　上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。

　　1.4　荧光标记的CD34单克隆抗体　33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ,Immunotec）和表达第3类抗原表位 8G12（ HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。

　　1.5　双标记CD34/CD45　APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。

　　1.6　统计学处理　用 t检验。

　　2　结果

　　2.1　溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。

　　2.2　同一样品经 1％多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9％～49.5％之间，平均CV值为 32.2％。

　　2.3　APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。

　　2.4　CD34-PE／CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5％，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3％。

　　3　讨论

　　FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果［1］。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1％～ 6％，批间变异＜20％的国际质控标准［2］。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高［2］，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD34+细胞，结果是否有差异，则报道不一［3,4］。本研究的结果表明无显著性差异。

　　各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08％～19.31％，CV值为100.1％～136.6％［1］。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ISHAGE）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法［5］，建议双标记CD34-PE／CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干／祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光（SSC）一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开［4］。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群［5］。

　　应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC［6］；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性［7］；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。

　　基金项目：本课题受国家“九·五”攻关课题(96-906-01-12)和国家教委

　　高等学校博士学科点专项科研基金资助

　　作者简介：韩晓红，女，31岁，助理研究员，从事自体外周血造血干细

　　胞移植实验及实验肿瘤学研究；

　　石远凯，男，39岁，主任医师，硕士生导师，从事肿瘤内科及

　　自体外周血干细胞移植治疗恶性实体瘤的临床与实验研究

　　参考文献：

　　［1］ Lowdell M W, Bainbridge D R. External quality assurance for CD34 cell enumeration-results of a preliminary national trial . Bone Marrow Trans-　　plantation , 1996 ; 17(5): 849

　　［2］Siena S , Bregni M , Brando B et al. Flow cytometry for clinical estimation of circulating hematopoietic progenitors for autologous transplantation in cancer patients . Blood , 1991 ; 77(2) : 400

　　［3］Titley I , Healy L E , Scott M 　et al. Extent of variability inherent in measurements of CD34-positive cells in different human hemapoietic tissues . Bone Marrow Transplantation , 1995; 16(4) : 611

　　［4］Sutherland D R , Keating A , Nayar R et al. Sensitive detection and enumeration of CD34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp Hematology, 1994 ; 22(10) : 1003

　　［5］Sutherland D R , Anderson L , Keeney M et al. The ISHAGE for CD34+ cell deterination by flow cytometry . J Hematotherapy , 1996 ; 5(3) : 213

　　［6］Lumley M A , McDonald D F , Czarnecka H M et al. Quality assurance of CD34+ cell stimation in leucapheresis products . Bone Marrow Transplantation ,1996 ; 18 (4): 791

　　［7］Chang A , David D F M A . The influence of flow cytometric gating strategy on the standardization of CD34+ cell quantitation : an Australian multicenter study .J Hematotherapy , 1996 ; 5 (6) : 605