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输血在大出血、重度贫血、白血病及肿瘤等疾病的治疗中是不可替代的治疗手段，然而，血源紧缺的“警钟”随时可能敲响，为此我们将血红细胞加以物理化学修饰，由此不仅将通用血源大幅扩展，而且可减少输血错误。另外，将RH阳性转化为RH阴性，可让种稀有血型红细胞在我国不再严重短缺。为了更好地扩展血源，我们还将目光瞄向了与人类红细胞最为接近的动物——猪，期望从它们那里获得更多的可用人源化红细胞，期望借助猪身突破造血干细胞体外增殖的技术瓶颈。我们有理由期待，有一天临床上将有源源不断的血液供应。
B型变O型让血液“通用” 错误输血是严重的医疗事故，可直接导致死亡，因此人们做了很多努力避免其发生，如今已经实行了复检供者血型和正反定型，但这些都不能完全避免错误输血的发生。此外，因血型鉴定错误、受血者识别错误等主观因素引发的错误输血发生率也居高不下，美国约为1人/1.4万单位，而输血传播疾病（如HIV、乙肝等）的发生率也不过是1人/200万单位。ABO血型不合导致死亡率约1人/80万单位，是输血死亡的首要原因。 从另一个角度看，我国人群中O、A、B和AB型分别占32％、30％、28％和10％，采集和储存基本按照该比例进行，然而，由于多种原因，时常出现某种血型血液供应告急，而其他型因过剩而浪费。在美国也存在类似现象，据报告显示因过期而浪费的红细胞竟达6％，这对本来就不充裕的血源来说无疑是雪上加霜。仅在2005年，北京市血液中心就3次发布各种血型血液告急的消息，血源短缺和偏型已经成为制约临床输血的一个重要因素。 因此，假如有一种“通用血”能够供临床使用，上面两个问题就可迎刃而解。说到通用型血，大多数人会想到O型血。O型红细胞不含A或B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地输给A、B、AB或O型的受血者，因此又被称为“通用型血”。通用型血是未来输血医学发展的方向，美国红十字学会血液中心科学主管预计未来几年内有望实现A、B或AB型红细胞到O型的转换，届时将只储存和使用O型红细胞（稀有血型除外），这将是输血医学的一场革命。 通用型血可以极大减少因ABO血型不合所致输血反应，明显提高输血安全性，顺利解决血液偏型难题，简化血液采集、储存和配型程序，提高血站和医院输血科的工作效率，输血成本可节省近9％。致力于人红细胞血型转换技术研发的美国ZymeQuest公司估计，通用型血在全球的市场潜值超过18亿美元/年。通用型血不仅具有巨大的临床价值和经济价值，还具有重要的军事价值和战略意义。在战争、恐怖袭击、巨大灾难和其他突发事件中，因未能及时输血而死亡的人数约占伤员死亡的50％，通用型血使用简便、迅速、安全，可提高应急输血保障能力，提高伤员的生存率。因此，我们开展了制备通用型血的研究工作，进行了B→O血型改造研究工作。 红细胞的血型是由其表面抗原的结构决定的。B型红细胞与O型红细胞结构的差别仅仅是B型的表面抗原糖链末端比O型多了一个半乳糖，如果将这个半乳糖去除，B型的结构就与O型完全一致，就可以将B型红细胞改造成通用的O型红细胞。α－半乳糖苷酶是一种外切酶，它可以作用于α－1，3糖苷键，就像一把剪刀，将B型红细胞表面抗原上最外端的半乳糖剪切下来，因此α－半乳糖苷酶是实现B→O血型改造的工具酶。我们以人B型红细胞为原料，并自制基因重组咖啡豆α－半乳糖苷酶（工具酶），改造B抗原，制备出人O型红细胞。 研究结果表明：我们制备的人O型红细胞具有正常的形态和功能，呈现出O型红细胞的血清学特征。目前这项技术已在全国八个血液中心进行推广，为使其标准化、简便化、自动化，我们已研究出血型改造仪，并申请国家发明专利。 军事医学科学院研究员章扬培 借助猪身扩增人类干细胞 造血干细胞可重建人体的造血功能，在治疗造血系统恶性肿瘤、遗传病、重症免疫缺陷病等方面具有广阔的应用前景。造血干细胞来源于骨髓、脐带血和动员后的外周血，但有限的数量限制了它的应用，而传统的扩增造血干细胞的方法又易导致其分化，丧失干细胞的特性。因此，体外扩增造血干细胞成为目前实验血液学家和临床血液学家关注的一大难题。 有学者曾利用胎羊未成熟的免疫和造血系统，成功建立了人/胎羊造血嵌合体模型，使研究者对人造血干细胞的生物学特性有了更进一步的认识。猪是公认的最佳异种器官来源，胎猪和新生猪具有不完全的免疫系统。研究表明猪的胸腺基质培养体系可以支持人的造血干细胞体外分化成T细胞；猪的微血管内皮细胞作为基质细胞结合细胞因子组合可扩增人的造血干细胞。从狒狒骨髓中分离的造血干细胞，在体外扩增后，重新植入清髓后的狒狒，能够重建造血。借鉴人造血干祖细胞在胎羊中的成功移植，我们用胎猪和新生猪作为人造血干祖细胞移植受体的初探，检测在正常的异种造血微环境中，人造血干细胞在胎猪和新生猪体内定居和扩增的生物学特性。除剖子宫移植手术胎猪流产外，剖腹壁移植手术产下的新生猪和其他手术移植的新生猪，在观察期内，无厌食、感染等症状；生长发育与对照猪一致，无一例死亡。说明新生猪能耐受一定量的外源抗原的植入。 注射后，在猪外周血中能检测到人源造血干细胞。剖腹给胎猪肌肉注射人脐血单个核细胞后，检测出生30d后的新生猪外周血，为0.2％和6％。移植人脐血单个核细胞的新生大白猪，检测移植20d、40d、60d后猪外周血中人源造血干细胞的比例分别为6.44％、37.78％、5.14％，90d时其外周血和骨髓中检测不到人源造血干细胞，这可能是随移植时间的延长，猪免疫系统的成熟，人源细胞逐渐被排斥，或人源细胞竞争不过猪体内的干细胞。试验结果提示建立人/猪造血嵌合体模型是有可能的，这种人/猪造血嵌合体有可能发展成人造血干细胞扩增的模型，用于突破人造血干细胞体外扩增的技术瓶颈，解决造血干细胞在实际应用中的数量不足。 军事医学科学院助理研究员檀英霞 Rh阳变阴稀有血型不稀有 Rh血型系统是红细胞中仅次于ABO血型的重要血型系统。Rh血型系统主要抗原有RhD、RhCc、RhEe，其中RhD抗原性最强。给RhD阴性人输用阳性血200ml，85％产生抗D。如果将RhD阳性血输给已产生抗D的人，会产生危及生命的溶血性输血反应，因此，Rh血型的D抗原具有重要的临床意义。在白种人中RhD（－）约占15％；在黑人中约占4％。居住在我国新疆的维吾尔族、哈萨克族、锡伯族、乌孜别克族和柯尔克孜族中，RhD（－）约占5％；而汉族人RhD（－）仅占0.2％～0.5％，可见汉族人RhD（－）的比例远小于白种人和黑人。我国RhD（－）血的供应长期存在不足，而且随着国际交往的增多这种矛盾日益突出，尤其是战争、自然灾害及一些大型的国际交流活动（如奥运会、世博会）时，对RhD（－）血的需求会大大增加。我国西部边远地区RhD（－）血液需求量也比内陆地区高。为此，我们尝试通过技术修饰将RhD（＋）红细胞改造成RhD（－）红细胞。 RhD血型的D抗原多肽由416个氨基酸组成，分析其氨基酸组成可以归纳出－NH2、－COOH、－SH、－OH、－CHO、－C＝O是抗原多肽链上暴露的活性基团。这提供了化学材料修饰的位点，如果选择合适的化学材料，针对性地对这些基团进行修饰，在红细胞表面形成一个遮蔽层，就可以有效遮蔽D抗原，既不会引起抗原抗体反应，又不会在反复输用后由于抗原刺激形成D抗体。 目前包裹法所用的化学材料主要是甲氧基聚乙二醇（mPEG）。mPEG具有许多优良的特性，例如亲水性（溶于水、有机溶剂、组织液）、优异的组织相容性、无免疫原性、抗血凝和抗巨噬细胞吞噬性等，其优良性状（包括成膜性、分散性、润滑性和释放性）可赋予被偶联的其他分子或细胞，并且无毒副作用，分子量小于50KD的mPEG可被机体顺利排除，因此mPEG已被美国食品药品监督管理局批准作为药用辅料。国外研究证明mPEG与卵清蛋白共价结合能够延长其在人体内的半寿期，并且不影响其生物活性和功能，反复输注不会引起免疫反应。 我们使用mPEG对人红细胞Rh血型的D抗原以及Duffy血型、MNS血型等共计6种血型系统的10种稀有血型抗原进行了有效的化学修饰，证明mPEG可以充分遮蔽上述血型抗原，改造成无稀有血型抗原性的通用型红细胞，且动物实验表明不影响红细胞正常结构和携氧功能，可在受试的动物体内正常活存。 北京市血液中心研究员张志欣 猪血代用解决供血矛盾 据统计，我国的血液年需求量约5000万单位，而实际年供应量仅1300万单位，仅能满足需求的1/3。因此，研制安全有效的人血替代品，开拓新血源十分必要。猪红细胞的各项生理生化指标与人红细胞非常相近，国际同行也正在开展对猪红细胞进行改造，使之成为人血代用品的研究，如能成功将会提供充足的血液资源，无疑具有重要的经济效益和社会效益。 猪红细胞的理化特性、大小、形态、结构和功能与人的极其相近。科学家一致认为猪红细胞（pRBC）是理想的人红细胞替代品。要达到猪红细胞供人输血使用，首先必须将猪红细胞的血型进行改造，使其与人红细胞有相同的血清学特性。猪红细胞与人红细胞表面抗原的差异可归纳为主要异种抗原和非主要异种抗原两种，主要异种抗原是α－Gal抗原，人血清中天然存在抗α－Gal抗原的抗体，因而猪红细胞的α－Gal是引起猪→人异种输血急性输血反应的主要障碍。 我们的研究探讨了利用基因重组α－半乳糖苷酶酶解（rα－GalE）清除猪红细胞的α－Gal抗原末端的α－Gal残基，进而用mPEG修饰遮蔽猪红细胞表面与人不同的非主要异种抗原，以期实现动物血型人源化的改造，为开拓新血源提供思路和方法。 我们首先采集无特定病原体猪血，分离出猪红细胞后，使用重组咖啡豆α－半乳糖苷酶进行酶解反应，去除猪红细胞表面主要异种抗原α－Gal，清除率可达99.42％。对酶解后的猪红细胞，再使用mPEG，遮蔽猪红细胞表面的非主要抗原。动物实验结果表明，经酶解和mPEG包裹双修饰的猪红细胞与猕猴血清的凝集反应完全消失，说明双修饰能有效地改造猪红细胞表面的异种抗原。 另从猕猴体内放血约12％，建立急性失血猕猴模型。失血猕猴表现出典型的贫血症状：面色苍白，其血红蛋白和红细胞压积在失血3h后分别降低了15％和13％，血清中的乳酸脱氢酶（LDH，糖酵解酶）升高了5倍。提示动物处于贫血缺氧的状态，并在输血前经静脉注射蛇毒免疫抑制因子和地塞米松。 然后将双修饰的猪红细胞用FITC荧光素标记，向急性失血猕猴静脉滴注双修饰的40ml猪压积红细胞和50ml羟乙基淀粉－生理盐水注射液。试验观察到急性失血猕猴面色变得红润，心率、血压、呼吸、血氧饱和度均正常，除尿红细胞外，血尿常规均在正常范围之内。在输入8小时内，猪红细胞在猕猴体内存活率仍高达38％。受试猕猴的血红蛋白和红细胞压积分别从失血状态的134g/L和44.8％恢复到正常水平的150g/L和50％，并且在输血后8小时内一直维持正常水平。这说明，经双修饰的猪红细胞在猕猴体内存活的一定时间内可发挥正常的携氧功能和治疗作用，提示异种间输血是有可能实现的。一旦能采用科学方法解决猪红细胞在人体内代谢所释放出的异原蛋白对人体的免疫威胁，将有可能开拓来源充足的人红细胞代用品，从根本上解决人血供不应求的矛盾。 军事医学科学院研究员宫锋 专家简介 章扬培军事医学科学院野战输血研究所研究员、博士生导师。曾任军事医学科学院基础医学研究所所长、军事医学科学院科技开发企业管理局局长。生物化学与分子生物学专家，主要研究领域：细胞DNA损伤与修复的研究；肿瘤预见性化疗研究；血型改造的研究；异种器官移植克服排斥反应研究。曾获全国科学大会奖一项，军队科技进步二等奖八项，三等奖一项。 |
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