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高内容筛选技术和RNAi技术结合可以用来筛选潜在的靶位点。然而，其产生的大量数据对信息管理来说却是个很大的挑战。
基因组学和转录谱的出现，为我们带来了数不清的新的药物靶位点。现在，实验过程变得非常简单，把癌细胞的RNA提取物与芯片杂交，它们就会和芯片上的许多靶分子结合，其实在芯片上实际发生的事情要复杂得多。美国百时美施贵宝公司（BMS）的Mark Cockett博士说：“靶位点的选择很不容易，有那么多的靶位点和潜在的靶位点，在具体的细胞系统或模型系统中选出最好的那个靶点，确实是个挑战。”因此，是高内容筛选（High Content Screening, HCS）大显身手的时候了。 高内容筛选是指在保持药用物质细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、调亡、代谢途径及信号传导各个环节的影响，在单个实验中获取大量相关信息，以确定其生物活性和潜在毒性。 HCS融合了自动化的图像获取和分析系统，可以检测哺乳动物细胞中结构和生物化学的变化。利用项技术，一次检测可以实现多种目的，研究人员已经开始从该技术中受益。同时， RNAi技术的出现，使研究人员可以大规模的降低基因表达。现在，研究人员可以把这两个工具结合起来，系统的对潜在靶位点进行筛选。利用HCS提供的丰富信息，可以找出重要分子，提供给化学家进行人工合成。然而，对于药物研发人员和仪器制造商来说，如何管理这些新出现的大量信息却是个很大的挑战。 2001年，当基因组学技术领域资深科学家Judith Wardwell-Swanson博士加入BMS时，该公司的转录谱研究正处于顶峰状态。研究人员需要用更快的方法去验证实验中获得的靶位点，管理层希望尽快开展哺乳动物靶点的筛选工作。Swanson博士说：“起初，我们用许多平板读取器和一台共聚焦显微镜对靶位点进行一个一个的验证，工作量非常大。我们需要一个统一的平台能够同时处理多个靶点，而HCS恰好能够实现这个目的。” Swanson博士早就开始留意能支持多重检测的研究平台，并于2003年从匹兹堡赛罗米公司（Cellomics Inc）买了一台ArrayScan仪，它也是现在仅有的几种HCS仪器之一。这台仪器是通过装在盒子里的一台荧光显微镜完成图像自动采集，使用的是96孔板的形式。它支持任何具有荧光终端的检测，类似于共聚焦显微镜的终端，Swanson研究组通常用共聚焦显微镜验证靶位点。 HCS协助验证 雅培（Abbott）的HTS研究组把加州MD（Molecular Devices）公司生产的仪器Discovery-1 HCS整合到自己的标准平板读取器中。分子仪器组项目主管David Burns博士认为，经过整合的仪器可以用来筛选标准仪器无法筛选到的具有表型变化的细胞。装上一个平板传送带，利用这台仪器，一天可以检测96或384孔形式的30个板。 最初，Swanson研究组对新检测方法进行了开发和验证，同时也对原有的检测方法进行了改进，使之与新的荧光格式相匹配。现在，他们可以做基因转录、蛋白质转移、蛋白磷酸化和细胞周期变化等方面的检测，筛选的靶位点包括G-蛋白偶联受体（GPCR）、激酶、其他信号传导因子和转录因子。Swanson称，用新方法进行的大多数分析都很好。 HCS最主要的优点是将靶点的鉴定和确认相结合。在鉴定过程中，如果高度可靠的靶位点越多，越容易进行靶位点的确定，鉴定成功率也越高。除此之外，高通量是HCS的另一个优点。现在，BMS研究人员可以通过HCS同时筛选数百个靶位点，筛选的规模还在不断扩大。 Swanson博士期望在未来几年，能够对成千上万的基因进行全基因组筛选，这可能需要借助具有更高通量的第二代仪器来实现。 RNAi用于全基因组筛选 随着RNAi试剂的改善，可以实现全基因组的筛选，RNAi试剂的开发和HCS仪器的出现遥相呼应。把RNAi应用于哺乳动物细胞上，siRNA（小干涉RNA）分子定靶于具有相同序列的信使RNA，特异下调其表达水平。只有HCS仪器能跟踪一个基因的表达下调以后，细胞中出现的细微表型的变化。Burns说：“HCS和siRNA的配合越来越紧密。” Swanson博士说：“在过去的一年时间里，RNAi试剂的效率和特异性都有了很大提高。同时，建库的成本也显著降低，这使得制药企业至少可以拥有重点关注的库。”而且，siRNA也可以很好的应用在更多的公共细胞模型上。对于转化困难或者需要长期基因下调的细胞，BMS研究人员则借助于短发卡RNAs（shRNAs）。在siRNA出现之前，雅培研究组利用小分子或者其他基因下调的方法进行靶位点筛选，但都不能直接的确定靶位点。Burns说：“这个方法使我们的工作第一次与治疗领域有如此紧密的接触，而其他方法都更像是在进行漫无目的的探索。” 从靶位点筛选到确定基因是否下调的次级分析很关键，HCS在这些后续的筛选过程中也起了重要作用。Burns研究组在4个库中筛选siRNA，之后考察单个的siRNA，确定究竟哪一个siRNA发挥了作用。他们还利用定量PCR去确定信使RNA的降低程度，利用抗体确定特殊蛋白质的表达下调。这些后续筛选应该与生理水平相关性更大，例如，细胞毒性试验之后进行细胞凋亡检测就是一例。Burns说：“一旦鉴定了一个siRNA，就需要大量的后续工作来确定这个siRNA的特异性，并且确定试验的正确性，即该siRNA正在使靶目标的表达下调。 成功率评估 进行siRNA分析，研究者必须用HCS算法去评估siRNA的转染效率。Burns说，有经验的研究人员观察一个细胞后，就知道siRNA是否对这个细胞起作用。但是，当同时有数千个不同的siRNA需要筛选，就必须让这个辨认过程实现自动化。“这需要研究人员、软件甚至是仪器供货商的通力合作，实现算法的自动运行。你可以拍到好照片，但你实际上需要软件和算法，以确定你正在进行的筛选是有意义的。” BMS研究人员首先用siRNA进行筛选，然后完成野生型、显性失活型和组成性cDNA激活型的筛选。Swanson博士认为siRNA更棒、更加容易合成、并更加易于纳入细胞。他们进行了大量的多元、多参数检测。例如，应用BMS多元的凋亡和细胞周期检测系统，能够进行人类细胞肿瘤靶位点验证。这个检测整合了几种凋亡的标记物，包括细胞色素C、对DNA染色显示核酸片断的caspace蛋白、从死细胞区分凋亡细胞的TOTO-3染料，以及用来区分细胞周期不同阶段的α-微管蛋白，等等。这里的终点测定可以是ELISA终点测定或者是个体终点测定，但是具有多元化的终端检测，并且能够在一个培养物中同时进行这些终端检测，才是其真正的与众不同之处。 对于一个特定通路来说，其他的通路都是特异的，这可能取决于鉴定靶位点的模型系统。例如，为了得到肿瘤靶位点的“通路连通性”信息，BMS研究人员可能需要启用他们的转录因子易位分析方法。在肿瘤学研究中，此类方法可以对标记了绿色荧光蛋白（GFP）的转录因子FOXO进行监视，后者参与细胞生长和凋亡。 数据分析瓶颈 BMS靶位点筛选的最大瓶颈是数据分析。Swanson博士说：“我们不再探讨单个的实验和单一的实验目的，我们面对的是多达2.5万个的数据点。我们开始着手分析HCS测得的全部的反应谱数据。这种全局的通盘考虑方式，已经开始产生大量的确定数据。”但是，对所有数据的可视化和分析仍然是一个巨大的挑战。利用现在的分析技术，即使对十几个平板筛选的小规模数据进行完全分析，也需要3_4周的时间。 HCS仪器使用者的这种需求，不断的给仪器制造商添加压力，促使其继续改进仪器。赛罗米公司信息部资深产品经理Mark Collins认为，把HCS数据整合到系统生物学方法中就是一个很大的挑战。“如何获得RNAi信息，对于干细胞研究它能发挥什么作用，以及如何把这些纳入到干细胞生长模型中？”在生物学领域，人们希望测定的东西越来越精细，“数据管理也必须变得精益求精，一方面需要管理更大规模的数据量，另一方面需要分析，并使这些数据可视化，以便从中获得最佳答案。” 人们对表型分析越来越感兴趣，赛罗米公司产品经理Sarah Tencza说：“传统上靠手工测量的物体，利用其他方法很难进行测量，如神经突的生长或者微核的形成等。现在可以对这些物体进行自动化检测。用户总是希望超越现有技术限制，寻找一些技术还无法筛选的靶位点。随着技术的发展，这些靶位点能够被筛选。然而，水涨船高，当新技术出现时，他们又希望找到一些更新、难以测量的靶位点。” Swanson博士认为，新的检测方法总是不断向前发展。每疾病都有其自己的通路，从一开始，就需要确立特异检测方法的安全性和有效性。利用HCS，Swanson她们一次使用4个标记物，对每个标记物检测多达20个的参数，这在以前是无法做到的。“当很多研究组还仅仅只是关注于单一目的检测的时候，我们已经开始综合的研究反应的全局特征。从长远来看，这有助于我们对靶位点的全面理解。” 链接：基于图像的生物学终点检测 赛罗米公司生物应用部经理Sarah Tencza认为，高内容筛选的关键是把不同的技术以适当的方式整合到仪器中去。赛罗米公司的Cellomics ArrayScan实现了全自动图像获取，从滤光器、放大倍数的选择到相机和曝光设定都是全自动的，并且图像分析软件也被整合到一起。图像分析的目标可以一直追溯到最开始的图像获取。仪器能够很快就完成图像分析，因此，当一次检测结束后，可以把所有的图像和化数据保存起来，以便随时查阅。 Tencza说：“仪器的目标是允许细胞生物学实验按一定比例进行量化，给出统计相关性和合适的产量。如果所关心的不仅仅是扫描时间或者图像的获取时间，而是从一个检测概念到结果获取需要的所有时间，在这个时候，把数据管理整合进来变得尤其重要。” 公司信息部资深产品经理Mark Collins认为，这种仪器不仅仅只是提供纯粹的图像分析。利用一个特殊的应用软件能够评估6类以上的主要细胞变化类型，从确定反应位点到跟踪形态变化、分子迁徙或强度等。对于每一类细胞，图像分析算法能够执行各种功能，包括统计分析、与对照比较或动力学参数测定，等等。例如，可以对细胞中的反应位点进行计数、测定其面积和强度。Collins说，这种设计“给终端用户提供的不仅仅是象素的数值，还为他们提供了生物学的相关性，以及验证过的检测数据。这是真正的基于图像的检测。”■ （译自《Drug Discovery & Development》） |
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