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日前，第四军医大学西京医院全军骨科研究所以及该院整形外科、肿瘤科专家，在国家自然科学基金资助下，成功地应用人工TATA盒(基本转录因子TFIID结合位点，位于转录起始点上游-25~-30bp，控制转录起始的准确性及频率)对人端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)核心启动子进行了修饰，并利用其构建了小发卡状RNA(sh RNA)表达载体，进而实现了肿瘤特异性RNA干扰(RNAi)。该研究为进一步提高基于RNAi技术的基因治疗方法的安全性奠定了基础。
已有研究表明，在85%以上的人类肿瘤细胞中，存在端粒酶的再激活。而作为肿瘤特异性启动子--hTER T，已被广泛用于靶向转录基因治疗研究中。RNA干扰是指双链RNA(dsRNA)介导的同源mRNA高效降解现象。该现象普遍存在于植物、真菌、线虫、果蝇和哺乳动物中，并在其进化中高度保守。目前，RNAi已经成为筛选新基因、探索基因功能和寻找有效药物靶点的重要工具。 为修饰hTERT核心启动子，构建shRNA表达载体，实现肿瘤特异性RNA干扰，西京医院的研究人员使用人工TATA盒修饰hTERT核心启动子，重建转录起点；将含有修饰后hTERT启动子的MluI/XhoI片断克隆至pGL3-OCP-shLuc的相应酶切位点，以获得pGL3-mhTERT-shLuc；设计了针对p53的s hRNA编码序列，并通过将XhoI/XbaI克隆至pGL3-mhTERT-shLuc的相应酶切位点之间，来获得 pGL3-mhTERT-shp53；利用pGL3-mhTERT-shLuc与pGL3-control共转染人骨肉瘤细胞U20S、MG-63和H0S，并以共转染lμgpGL3-control和lμgpGL3-mhTERT作为对照组，48小时后测定荧光素酶活性，并计算相对活性；利用WesternBlot法分析转染前后p53的表达水平。 该研究获得三项重要成果：经双酶切鉴定和DNA测序证实，pGL3-mhTERT-shLuc和pGL3 -mhTERT-shp53的序列与研究设计完全一致；pGL3-mhTERT-shLuc与pGL3-contro l共转染实验发现，hTERT-U20S细胞荧光素酶的相对活性与对照组相比没有明显差异，而hTERT+的MG-6 3和H0S细胞在转染后，其荧光素酶相对活性显著降低，与对照组相比其抑制效率可分别达到69.7%和71.0%；W esternBlot分析表明，与转染pGL3-mhTERT相比，使用pGL3-mhTERT-shp53转染MG -63和H0S后，可显著抑制p53表达，而U20S的p53的表达水平，与对照组没有明显改变。 据研究人员介绍，由于hTERT启动子是公认的肿瘤特异性启动子，而且hTERT高表达于多种类型肿瘤细胞和瘢痕组织中的成纤维细胞中，所以该启动子经修饰后不仅可用于乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等多种类型肿瘤的靶向基因治疗，而且可用于靶向杀伤瘢痕组织中的成纤维细胞，从而达到安全、有效治疗肿瘤和瘢痕的目的。上述研究通过对hTERT 核心启动子进行修饰并构建shRNA表达载体，成功实现了肿瘤特异性RNAi干扰，大大提高了基于RNAi的基因治疗策略的安全性。 |
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