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通过创建一个表达试剂盒，将短发夹型RNA序列包埋入由常见的小分子RNA构成的大型折叠链，科学家成功地进行了高效抑制目标基因的实验。
美国哈佛大学的Stephen Elledge研究小组和冷泉港实验室的Greg Hannon 和Scott Lowe两个研究小组一直密切合作，希望构建第二代短发夹型RNA(shRNA)文库。他们一贯的座右铭是“让细胞教你如何最有效地进行RNA干涉实验”。他们合作的目标就是开发出有效的筛选工具，来鉴别涉及肿瘤生长调控的必需基因；虽然以前的一个shRNA表达文库提供了很好的结果，但由于基因抑制而产生的“非最佳效果”也使得一文库并不完善。 这些研究者引入了由杜克大学的Brian Cullen最先使用的实验方案：利用细胞内源RNA干涉(RNAi)机制，对包埋在一个大型“小分子RNA”折叠链中的shRNA进行加工和裂解，从而获得干涉性小RNA分子的更多稳定表达。Hannon和Elledge构建了以小分子RNA为基础的大型shRNA载体文库，这些载体的靶点涉及人类和小鼠的很多基因；他们观察到了比用以前的shRNA文库更为有效的基因抑制现象。 新创建的文库还具有另外的优点，那就是使得某类克隆变得更为容易起来，这类克隆允许任何类型的shRNA快速插入到小分子RNA折叠链中，而且还包括对启动子的选择。虽然新文库由一个RNA聚合酶III启动子驱动，细胞利用这个启动子服务于小的非编码性RNA，但像mRNA这类的小分子RNA却由RNA聚合酶II启动子来转录。这些启动子导致大量而稳定的转录发生，其中最重要的就是它们具有了可诱导性。 由于对能否构建一个可诱导性的shRNA文库的问题特别感兴趣，Elledge 和 Lowe的两个研究小组在由四环素调控的RNA聚合酶II启动子的控制下，各自独立地克隆了小分子RNA-shRNA模块；即使仅有单个的shRNA载体拷贝被整合到宿主基因组中，也显示出了在细胞培养物中对基因抑制发生与否的强烈控制。另外，Lowe研究小组的Ross Dickins发现，被一个致癌基因和一个目标物为p53的可诱导性shRNA载体感染的细胞所引发的肿瘤生长，取决于shRNA的诱导情况。关闭shRNA会引起p53的再表达和肿瘤的收缩。Dickins观察到了这一系统在肿瘤治疗靶点鉴定过程中的一个重要用途。他说：“像我们这样的实验可为瞄准代谢途径中的一些特定成份提供一个理性基础，根据在于shRNA能模拟一个目标治疗剂。”如果对一个基因的抑制能引起一类肿瘤的收缩，那么以该基因为目标靶点的药物也将最有可能具有同样的治疗效果。 从一个细胞拥有的RNAi机制来学习如何对基因表达进行最优化管理，也许被证明是一种更好地了解甚至是杀灭肿瘤细胞的有效工具。 注：夏雨译自2005年12月号的《自然-方法学》，版权为英国NPG出版集团所有。更多信息请访问：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods |
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