摘要
利用小分子物质特异性沉默基因表达是有效的治疗手段，许多研究正在利用些小分子物质的作用而创造出新的治疗性药物.小干扰RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)最有可能成为这类药物中的新成员.本文将从siRNAs的沉默机制、基因沉默效率、表达载体，siRNAs在活体内的应用以及作为可能的治疗性药物等方面，探讨其应用于临床治疗的巨大潜能.
胡迎宾, 李定国. siRNAs在基因治疗中的应用. 世界华人消化杂志 2005;13(16):2040-2042
http://www.wjgnet.com/1009-3079/13/2040.asp
0 引言
小干扰RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)是RNA干扰(RNA interference，RNAi)过程中的效应分子.Fire et al[1]在1998年向秀丽隐杆线虫中注射双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子后降解了细胞质中含有同源序列的靶mRNA.随后的研究表明，RNAi现象广泛存在于真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠及大鼠等大多数真核生物中.早期在哺乳动物细胞中应用长dsRNA可引起非特异性干扰素反应而导致细胞死亡，后来遗传学和生物化学研究证明将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs后不引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段.
1 siRNAs的沉默机制
siRNAs是由RNase-III家族中被称为Dicer的核酸内切酶在细胞质中剪切自然存在的长dsRNA的过程中产生的.Dicer将长dsRNA剪切为21-28个核苷酸的siRNA双链.这种siRNA双链除了在5’末端是磷酸，3’末端是羟基外，3’端还有由2个核苷酸构成的悬突.siRNA双链与诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的.现在siRNA能够像核酶一样通过化学合成的方法或者通过载体表达双链短发夹样RNA(short hairpin-like RNA，shRNA)进入到细胞内，后者在细胞内可转化为siRNA而发挥基因沉默效应.一些研究证明siRNAs还有其他沉默机制，例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默[2-3].
miRNAs(microRNAs)是一类非编码小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，调节细胞内基因表达.成熟的miRNA是由胞质中70个核苷酸组成的发夹样结构前体剪切为21-22个核苷酸分子组成的单链.他们组装成蛋白复合体(miRNP)后在核糖体内与mRNA3’端非翻译区部分互补结合从而阻止mRNA的翻译.如果与同源性靶mRNA完全互补结合，那么miRNAs像siRNAs一样能够通过正反馈途径循环降解靶mRNA.
2 siRNAs的基因沉默效率及其安全性
各种基因沉默的方法是否能够高效作用于靶目标仍然是其应用于治疗的一个关键问题.Harborth et al[4]研究表明RNA结合蛋白，mRNA的二级结构和三级结构能够影响siRNA的沉默效率.绝大多数研究都证实siRNAs比各种寡脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleic acids，ODNs)更有效，并且作用时间更长.作用于同样的靶目标siRNAs的半数最大抑制浓度(IC50)比磷硫酰修饰的ODNs低100-1 000倍.尽管尚未对siRNAs与核酶和/或DNA酶的效率进行广泛地系统性比较，但Drew et al[5]研究表明siRNAs比核酶和/或DNA酶更有效，且具有长发夹结构的RNA比锤头结构的核酶能更强烈的抑制靶基因表达.
低浓度的siRNAs就能启动基因沉默的过程，因为他们能快速、特异性与RISC结合，从而减少了与非特异性蛋白结合的可能，这有利于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应.事实上已有研究证明转染中等浓度的siRNAs并不引起全身非特异性反应[6].也有三项研究[7-9]认为siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型、转染试剂以及siRNAs的转染方式有关.这些非特异性反应包括刺激基因亚型引起的干扰素反应，但研究并非像人们想象的那样，所产生的干扰素反应并不影响细胞生长.
3 siRNAs的表达载体
由于siRNAs既可以通过化学合成获得，也可以通过载体表达，这使具有靶向性的药物应用于基因治疗成为可能.表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子(RNA polymerase III promoter，pol III)或RNA聚合酶II启动子(pol II)序列，首先转录生成与miRNA前体相似的shRNA，然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应.在活体内和培养组织细胞中应用表达siRNA的载体能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因.许多研究证明腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体、逆转录病毒载体及慢病毒载体都能有效转染到活体内和培养细胞中.Shinagawa et al[10]研究表明含pol II的表达载体能在体内产生由数百个碱基对构成的shRNA，而不诱导非特异性干扰素反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法.
4 siRNAs在活体中的应用
通过电穿孔、局部注射或静脉注射的方法已经能够成功地将化学合成的siRNAs、表达siRNAs的质粒以及表达siRNAs的病毒导入到哺乳动物细胞中.但很难评价哪种方法能更有效的引起基因沉默.经鼠尾静脉高压注射溶于生理盐水的siRNA已经成功地将siRNA导入大鼠组织中，其中在肝中靶基因的沉默效率达90%以上，而在肺、肾、脾、胰中靶基因的沉默效率稍低[11-12].采用这种方法引起的基因沉默效应一般持续数天，在有些情况下可超过1 wk，并且基因沉默的效率因物种的差异而不同.
表达siRNAs的病毒载体为研究哺乳动物的基因功能提供了新方法，更为治疗人类主要疾病带来了新希望.已经有几种病毒被设计用于表达siRNAs.重组AAV能在哺乳动物分裂期细胞和静止期细胞中长期表达siRNA.他们通常以附加体的形式随机、低频整合到宿主基因组中.有研究[13]表明向大鼠脑内注射表达siRNA的AAV载体能引起长达7 wk之久的基因沉默效应.在HIV感染的组织模型中表达siRNA病毒载体也被成功地应用于治疗[14].
现在又有几种新的方法将siRNAs导入活体内.最近有研究[15]表明大分子能够促进几种小分子物质经皮吸收，包括siRNAs分子.这将有利于siRNAs经皮吸收进入全身血液循环发挥治疗性药物的作用.将含siRNAs的气溶胶导入肺内也能起到基因治疗的作用[16].
5 以siRNAs为基础的基因治疗
虽然siRNA在哺乳动物细胞中的应用仅仅4 a，但他正以飞快地速度发展成为基因治疗的一种新方法.如果siRNAs通过尾静脉高压注射能有效到达肝脏，那么他将可以广泛应用于治疗各种肝病.通过沉默肝中内源性凋亡基因的表达，经抗凋亡酶Caspase-8或者抗Fas细胞死亡受体的siRNAs预处理的小鼠能有效预防各种试剂诱导的急性肝功能衰竭;用同样的siRNA也能够治疗已经发生的肝损伤[11-12].siRNAs通过抑制病毒自身或者抑制病毒转录所必须的辅助因子达到抗病毒的目的.将乙型肝炎病毒(HBV)基因组和siRNAs共转染可以有效降低HBV的复制水平和蛋白合成[17].Wohlbold et al[18]证明用siRNAs能有效沉默异常BCR-ABL融合基因表达，而不影响正常c-BCR和c-ABL的转录，这为治疗Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病提供了新方法.
在血浆中siRNAs双链能抵抗核酸内切酶的降解作用，但这并不意味着他能够稳定地存在于机体内.因为未被修饰的siRNAs不能迅速进入细胞内，或者与血浆蛋白亲和力低而较早地被机体清除.如果不是通过表达siRNAs载体的方法，那么必须经过化学修饰的siRNAs才能更有效的作为基因治疗的手段.有研究[19-20]正通过硫磷酰修饰siRNA提高细胞的摄取能力，从而增强基因沉默的效果.去年美国FDA已批准经过修饰的siRNAs进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变(age-related macular degeneration)的[21].最近Soutschek et al[22]经鼠尾静脉注射胆固醇修饰的抗apoB siRNA能有效沉默同源性靶基因的过度表达，并且证实经修饰的抗apoB siRNA导致小鼠胆固醇水平降低的程度与apoB基因敲除小鼠的水平相近，这实现了siRNA作为静脉注射性治疗药物的可能.
siRNAs作为一种新的基因治疗方法引起了许多研究者的兴趣，在很大程度上是因为其作为细胞内源性基因表达调节物质的低毒性和特异性，另外一方面则是其比ODNs、核酶有更强的基因沉默效率.然而将siRNAs应用于临床治疗还存在一些挑战，如将siRNAs导入细胞内的最佳方法及如何获得更高效率，如何避免脱靶现象及非特异性反应.因此，进一步深入研究RNAi的机制将会丰富我们对基因表达调控的认识，也将有利于基因治疗的实际应用.
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胡迎宾, 李定国, 上海第二医科大学附属新华医院消化内科 上海市 200092
通讯作者: 李定国, 200092, 上海市, 上海第二医科大学附属新华医院消化内科. [email protected]
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