消化系统癌肿的自杀基因疗法 4

细胞生长于非增生性、相对正常的肝组织中，而用于基因转移的逆转录病毒载体对增殖旺盛的细胞最有亲和力. 体外实验表明，HSV-tk基因转染的肝肿瘤细胞对GCV的敏感性是野生型细胞的500倍～1000倍［39］；②由于70%的肝细胞癌表达甲胎蛋白(AFP)，而正常肝细胞不表达此种蛋白，因此如应用AFP基因作为启动子，可提高基因转录载体的靶向性，增加目的基因转染肝癌细胞的效果［6，39-41］；③，由于肝肿瘤的血液供应主要来自肝动脉，因此如果从肝动脉输注基因转移载体和前药，可能进一步增加基因转移的靶向性，减少副作用［39］. Gerolami et al［42］在二乙基硝胺肝癌鼠模型，比较了经门脉、肝动脉和瘤内直接注射等3种途径输注重组腺病毒载体的效果，发现以肝动脉输注产生的肿瘤抑制效应最显著. HSV-tk/GCV对肝肿瘤的抑制作用尚见于肝外输注自杀基因时，此很可能系“距离性旁观者效应”发挥了作用. 向鼠腹腔内注入HSV-tk+和HSV-tk-结肠癌细胞，10d后，再向肝内注入HSV-tk-结肠癌细胞，所有动物均接受GCV. 结果显示，不仅腹腔内HSV-tk+肿瘤和HSV-tk-肿瘤相比，明显退缩，而且肝内HSV-tk-肿瘤在腹腔HSV-tk+肿瘤鼠也小于腹腔HSV-tk-肿瘤鼠. 腹腔HSV-tk+肿瘤鼠的肝内肿瘤内有大量单核细胞浸润，伴纤维化，仅偶见存活的肿瘤细胞.

　　3.2　结直肠癌　CD/5FC系统看来更适合于治疗结直肠癌. 体外实验表明培养的结肠癌细胞中只要1/3表达胞嘧啶脱氨酶(CD)，即足以使前药5FC转化为足够浓度的5FC，而使全部癌细胞的生长受到抑制；皮下移植的结肠癌组织中只要2%的癌细胞表达CD，在给予5FC后，肿瘤生长即完全停止. 如果将载有CD基因的腺病毒载体，直接注射入裸鼠皮下移植性结肠肿瘤内，再给予5FC，引起肿瘤缩小3/4～4/5. Rowley et al［17］报告表达CD的结直肠癌细胞对5FC的敏感性，比不表达CD的腺癌细胞高200倍以上，在7d内，90%以上癌细胞被杀死. 有人比较了经基因改造的结直肠癌细胞对前药5FC或GCV的敏感性，发现GCV对HSV-tk+细胞的50%抑制浓度(IC50)为对野生型细胞的1/140，而5FC对CD+细胞的IC50仅为对野生型细胞的1/960；移植瘤内如果HSV-tk+细胞少于10%，则不显示抗肿瘤效应，而CD+细胞仅需4%，实验动物肿瘤生长便受到抑制.

　　结直肠癌对CD/5FC更为敏感的原因可能为：①肿瘤本身对5FC具有内在敏感性；②CD/5FC系统的旁观者效应(BSE)较显著. 在此系统中，BSE不取决于细胞-细胞间接触，而取决于5FC的细胞间自由弥散. 现认为结直肠癌对HSV-tk/GCV的敏感性与癌细胞的类型有关. Link et al［43］发现在由HSV-tk+和HSV-tk-结直肠癌细胞构建的种植瘤，如果HSV-tk+细胞在全部癌细胞中占9%，在给予GCV后，发生肿瘤退缩；但某些类型HSV-tk+结直肠癌细胞对GCV呈现抗性，进一步研究发现这些细胞内HSV/tk基因部分或完全性脱落，免疫组化研究显示细胞内HSV/tk蛋白缺乏［44］. McMaster et al［45］发现三种结肠癌细胞株中有二种在HSV-tk/GCV作用期间无明显BSE发生. 分子杂交技术虽然在这些细胞测到裂隙连接蛋白connexin43，但免疫组化研究显示，这种蛋白存在于细胞浆内，而不是在细胞表面；相反，呈现强有力BSE的结直肠癌细胞表面有connexin43表达. 由于细胞表面connexin43表达是HSV-tk/GCV治疗时BSE发生的必要条件，因此某些类型结直肠癌细胞对HSV-tk/GCV缺乏敏感性［31］，可能主要与BSE不足有关，这对基因治疗方法和适合病例的选择具有实际意义.

　　3.3　胰癌　1994年DiMaio et al用重组逆转录病毒载体，将HSV-tk基因转染胰癌细胞. 给免疫缺陷鼠皮下注射以各种比例混合的HSV-tk+和野生型胰癌细胞，全部动物均发生胰癌. 给予GCV后，肿瘤明显消退，即使仅含10% HSV-tk+细胞的肿瘤也显示瘤体积明显缩小. 应用CEA基因作为启动子，可提高病毒载体将目的基因转入产CEA性胰癌细胞的耙向性. Ohashi et al［46］发现，用表达HSV-tk基因的腺病毒载体转染胰癌细胞时，如采用一般的启动子，则癌细胞对GCV的敏感性与CEA产生无关，如果采用CEA启动子，则GCV杀伤作用在产CEA细胞明显增强. 在胰癌的自杀基因/前药治疗中，BSE甚为显著. Green et al［24］应用硝基还原酶ND/CB1954系统，发现胰癌细胞转染ND基因后，对CB1954的敏感性提高500倍，在与野生型细胞混合培养中，只要10%的胰癌细胞表达ND，即足以引起强大BSE. 对于腹腔转移性胰癌，腹腔内输注表达自杀基因的病毒载体，往往可有效地诱发BSE. Rosenfeld et al［47］给BALB/c裸鼠腹腔内注入胰癌细胞诱发肿瘤形成，再注入表达HSV-tk基因的腺病毒载体，在注射GCV后，肿瘤明显退缩，伴有强大BSE出现. Aoki et al［48］作过类似实验， 但采用脂质体作为载体，将HSV-tk基因注入腹腔，对照组24只鼠全部出现胰肿瘤伴腹腔播散，而治疗组14只鼠中8只未见肿瘤生长.

　　3.4　胃癌　Yoshida et al［49］将包装有HSV-tk基因的逆转录病毒转染胃癌细胞，发现这种细胞对GCV呈现剂量和时间依赖性反应，在体外实验中低至0.1μg/mL的GCV即可将胃癌细胞杀灭；在13只皮下接种HSV-tk+胃癌细胞的裸鼠中，12只的肿瘤在给予GCV后显著退缩. 与结直肠癌相似，胃癌对HSV-tk/GCV的敏感性也以产CEA细胞最高. Tanaka et al［50］应用含CEA启动子的重组逆转录病毒转染HSV-tk基因，发现腹腔注射这种重组逆转录病毒后，30%产CEA性胃癌细胞选择性表达HSV-tk基因，给予GCV后，肿瘤生长较未给予GCV的对照组减少20%. 类似地，如果以CEA基因作为启动子，腺病毒载体也可将CD基因选择性转染于CEA阳性胃癌细胞. 有人认为，腹腔内注射以CEA基因作为启动子的腺病毒介导的CD/5FU，可能是治疗播散性胃癌的新途径.

　　4　问题和前景

　　4.1　安全性　由于本身无毒性的前药，仅在表达自杀基因的瘤细胞内才被转化为活性物质，引起后者局部高浓度，因此，在理论上，本疗法不会引起全身性副作用. 动物实验证明这种疗法是安全的. 临床Ⅰ/Ⅱ期试验同样显示本疗法不会引起严重的副作用. Klatzmann et al用鼠细胞包装表达HSV-tk基因的逆转录病毒，然后将这种鼠细胞注入黑素瘤瘤体内，每次108～3×109细胞，共1次～3次，然后给予GCV 5mg/kg，2次/d，共14d. 共治疗8例患者. 治疗后3d～9d于注射局部发生炎症反应，多数持续几天后消失；伴中等度发热，持续24h后自退. 无其他