摘 要 目的：探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。方法：采用细胞培养，反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞，经多聚酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析技术，对14例纯化乳腺癌细胞标本、14例新鲜未纯化标本和27例石蜡包埋标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因突变率进行了对比性研究。结果：纯化的乳腺癌细胞组p16基因突变率为42.9%(6/14)，而新鲜未纯化细胞组、石蜡包埋细胞组及癌旁乳腺细胞组的p16基因突变率分别为7.1%、7.4%、4.9%，纯化乳腺癌细胞组的突变检出率显著高于其它3组，差异有显著性意义（P＜0.01)，其它3组突变检出率差异无显著意义（P＞0.05)。结论：在原发性乳腺癌中p16基因的纯合性缺失和小片段基因丢失可能是其失活的主要模式；纯化的癌细胞标本可大大提高p16基因的突变检出率。
我们采用细胞培养，反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞，经多聚酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析技术对14例纯化乳腺癌细胞标本，14例新鲜未纯化乳腺癌标本，27例中性福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因的3对外显子进行了检测。以探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。
资料与方法
1．标本：41例原发性乳腺癌标本为我院1997～1998年的手术患者，均为女性；年龄35～68岁。其中27例乳腺癌组织常规取材，经中性福尔马林固定12 h后，石蜡包埋，连续切片11张，1张行HE染色，10张经充分剔除周围非肿瘤组织后，留置作DNA抽提；14例术中取癌组织冰冻病理检查，对照HE染色，选取无坏死的肿瘤细胞集中部分取材，立即置入Hank′s液中，4℃冰箱暂存不超过24 h。所有病例均取癌旁乳腺组织标本置-20℃冰箱冻存。
2．实验材料与方法：12孔、24孔细胞培养板；CO2细胞培养恒温箱；倒置微生物显微镜；-20℃、-80 ℃低温冰箱；层流超净工作台；PCR仪；DYY-Ⅲ型稳压电泳仪；DYY-Ⅲ6型转移电泳仪；Hoefer mighty SmallⅡ电泳系统；紫外分光光度计。PCR引物由中科院上海植物生理所植物分子遗传实验室合成。引物序列参见文献［1，2］。
细胞培养、反复贴壁纯化癌细胞法按文献［3］方法。模板DNA的制备按文献［4，5］方法。所有DNA样本经紫外分光光度检测波长为260 nm及230 nm处的OD值，OD值均大于1.8。多聚酶链反应（PCR）按文献［2，5］方法。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳、鉴定。PCR产物的SSCP分析按文献［6］的方法。
3．统计学方法：用Fisher′s精确概率计算法（sas6.08），结果经t检验。
结 果
实验中建立了稳定的p16基因1～3外显子(exon)片断的PCR-SSCP检测体系。在27例石蜡包埋原发性乳腺癌标本中，1例p16基因exon1～3未见相应的扩增片段；1例exon 3未见扩增片段。14例新鲜未纯化癌标本中，1例未见exon1，1例未见exon 3相应的扩增片段。14例纯化癌细胞标本中，1例exon1～3均未见扩增片段，2例未见exon 1～2扩增片段，2例未见exon 3扩增片段。在全部扩增阳性癌标本中，仅有1例纯化癌细胞标本的p16基因第2 exon出现异常SSCP泳动条带。
纯化癌细胞组p16基因突变率为42.9%(6/14)，石蜡包埋癌细胞组、新鲜未纯化癌细胞组及癌旁乳腺组织细胞组分别为7.4%、7.1%、4.9%，纯化癌细胞组突变检出率显著高于其他3组，差异有显著性意义（P＜0.01），其他3组之间差异无显著意义（P＞0.05）。
讨 论
p16基因位于人类染色体9q21，有2个内含子和3个exon组成［1］，是一种重要的肿瘤抑制基因。了解乳腺癌患者p16基因的状态，不仅可以分析它们之间的关系和作用机制，更重要的是对乳腺癌的病因学、生长特性、诊断和临床治疗诸方面的研究具有指导意义。
Geradts等［7，8］用免疫组织化学法发现乳腺癌细胞p16基因蛋白缺失，总异常率为49%。郭山春等［9，10］报道乳腺癌中p16蛋白缺失率68.2%，且缺失率与PCNA指数及淋巴结转移呈明显正相关。以上研究表明p16基因状态与乳腺癌的病理过程有关，p16基因失活将导致细胞周期调节环路失调，细胞过度增殖，从而成为乳腺癌发生的直接原因。检测p16基因的活性状态，能判断乳腺癌增殖、侵袭和转移的能力。
乳腺癌属体表肿瘤，一般发现及治疗均较早，肿块体积小。癌组织与乳腺良性增生性病变及正常乳腺组织交叉分布，取材不易排除间质细胞干扰。既往所采用的石蜡包埋和未纯化癌组织标本，癌组织易受间质细胞污染，且癌细胞中的p16基因纯合性缺失常被掩盖。
因此，p16基因突变的检出率常常低于实际的突变率。为了较精确地评估乳腺癌中p16基因突变的形式及频率，我们应用短期培养、反复贴壁法纯化乳腺癌细胞［3］，分次留置标本进行PCR-SSCP检测p16基因缺失突变率。观察到14例新鲜纯化乳腺癌癌细胞标本有5例纯和性缺失，1例突变，其突变检出率显著高于未纯化的乳癌标本（P＜0.05）及癌旁乳腺组织标本（P＜0.01）。以上结果与一组成胶质细胞肿瘤的研究相似。表明纯化乳腺癌细胞能提高p16基因突变的检出率。并且在细胞培养板孔中操作简单，易于动态观察细胞的变化，便于大量标本的同时检测；短期培养可排除肿瘤细胞在体外培养过程中造成的p16基因突变的可能性，较真实地反映了乳腺癌的生物学特点，值得在临床中推广应用。
作者单位：王本忠 230022 合肥，安徽医科大学附属医院普外科
朱新生 230022 合肥，安徽医科大学附属医院普外科
参考文献
［1］Kamb A, Gruis NA,Weaver F,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science,1994,264:436-440.
［2］Ohta M,Nagai H,Shimizl M,et al.Rarity of somatic and germline mutations of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor gene,CDK41,in melanoma.Cancer Res，1994,54:5269-5272.
［3］王蘅文,主编.实验肿瘤学基础.第1版.北京：人民卫生出版社,1992.25-26.
［4］姜泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用方法.第1版.北京：人民军医出版社，1996．111-112.
［5］林万明，主编.PCR技术操作和应用指南.
