受体介导基因转移的策略研究与进展

　　摘要 基因转移是基因治疗中一个关键的环节。受体介导的基因转移具有靶向、有效和安全、无毒的特点，且操作简便，因此有望成为一种理想的体内基因转移技术用于基因治疗。

　　关键词 受体介导；基因转移

　　受体介导的基因转移是将目的基因与配体连接，通过配体与细胞表面的特异性受体结合，以受体介导的内吞作用将目的基因转入细胞。配体与受体的特异性结合以及受体介导的内吞作用是一种生理过程，因此受体介导的基因转移有靶向、有效和安全、无毒的特点，这使它和其它基因转移技术相比具有独特的优势，尤其是用于体内基因转移。

　　1 方法和原理

　　配体与目的基因的连接，一般是通过多聚赖氨酸等多聚阳离子。配体与这些多聚阳离子的连接，是通过加入化学物质，形成共价的化学结合，然后与含目的基因的质粒以适当的比例在室温下混合。带负电荷的质粒DNA与多聚阳离子形成牢固、稳定的非共价电性结合。这种结合方式决定了DNA的表达不受影响。结合后的DNA缩合成致密的杆状或球状，外周覆盖着多聚阳离子和配体，此配体-多聚阳离子-DNA复合物呈可溶性，直径约100nm[1]，通过受体介导的内吞作用进入细胞后形成囊泡状的核内体。最终部分核内体与溶酶体融合，DNA被溶酶体酶降解，部分核内体膜破裂后DNA进入细胞质，再进入细胞核内进行基因表达。也有将配体嵌入包裹目的基因的磷脂双层中[2]，或将目的基因与含配体的融合蛋白连接[3]进行受体介导的靶向性基因转移。

　　2 受体介导的基因转移类型

　　2.1 脱唾液酸糖蛋白受体介导的基因转移

　　脱唾液酸糖蛋白受体是肝细胞表面独有的受体。Wu等以此受体介导，将HBV病毒的反义DNA转入体外培养已感染HBV病毒的人肝癌HepG2细胞，可使HBV病毒复制明显受到抑制，24h后HBV表面抗原及HBV的DNA均较无配体对照组下降约80%，而且6d内无明显上升[4]。用于体内，Wu等给小鼠静脉注射细菌的氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）与脱唾液酸糖蛋白复合物，10min后处死动物，发现32P标记的DNA85%分布在肝脏，5%在血中，并在肝组织检测到酶活性。而单独注射CAT的对照组仅17%在肝脏，46%停留在血中，肝组织未检互酶活性[5]。以此受体介导将低密度脂蛋白受体基因转入缺乏此基因的免疫体内，使高脂血症得到部分纠正[6]。说明脱唾液酸糖蛋白受体介导的体内基因转移具有很高的靶向性和有效性，提示多种与肝脏酶缺陷有关的遗传性疾病有望通过此受体介导达到基因治疗的目的。

　　2.2 甘露糖受体介导的基因转移

　　甘露糖受体存在于巨噬细胞表面，此受体介导，将肿瘤坏死因子（TNF-α）反义RNA转入体外与二氧化硅共孵育的巨噬细胞，可阻止巨噬细胞在二氧化硅诱导下分泌TNF多的作用，TNF分泌量仅为无配体对照组的1/5[7]。给小鼠静脉注射含荧光素酶基因的质粒与甘露糖化多聚赖氨酸复合物，在脾、肝、肺均检测到酶活性。其中以脾脏组织酶活性最高[8]，这和巨噬细胞最富集于脾脏相一致，说明甘露糖受体在体内基因转移中也具有器官靶向性。

　　2.3 胰岛素受体介导的基因转移

　　胰岛素受体存在于多种组织细胞表面，因此在体内基因转移中往往缺乏专一的器官靶向性。Sobolver等成功地进行了胰岛素受体介导的小鼠和羊乳腺上皮细胞体外基因转移后。采用局部途径给药的方法，经小鼠和羊乳腺导管注射荧光素酶基因与胰岛素复合物，在乳腺组织中检测到酶活性，将人β-乳清蛋白基因与荧光素酶基因连接后以同样方法体内应用，在乳液中也检测到酶活性[9]，说明受体介导的体内基因转移不但能够合成细胞内蛋白，而且还能合成分泌型蛋白。

　　其他学者还进行了转铁蛋白受体[10]、成纤维生长因子受体[11]、叶酸受体[2]、c-kit[12]受体以及单克隆抗体为配体[1]的受体介导的体外基因转移。

　　3 提高体外基因转染效率的策略

　　受体介导的基因转移中，不同细胞、不同受体转移率亦不同。与细胞表面受体密度、配体与受体的亲和力等因素有关。由于在部分外源基因进入细胞后容易被溶酶体酶降解，因此一般来说受体介导的基因转移效率较低，但是通过采取措施可获得较理想的效果：加入双岐性分子氯奎，利用氯奎的弱碱性阻止核内体的酸化，进而阻止其与溶酶体融合。DNA被溶酶体酶降解几率减少，进入核内的量增加，使基因表达增强。在受体介导的体外基因转移中，加入100μmol/L氯奎，能使转染率由0.1%提高到1%[1]。

　　加入膜不稳定剂，促进核内体膜破裂使目的基因进入细胞质，进而进入核内进行基因表达：①加入复制缺陷腺病毒或将复制缺陷腺病毒与目的的基因配体复合物连接，利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用，可使基因转染率提高至近100%。所加病毒数量相同时，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因配体复合物效率更高[13]。用脂补骨素或紫外线照射灭活腺病毒核酸，但保留病毒衣壳蛋白功能，能提高基因转移率并可避免病毒核酸进入细胞的危险性[11]。②加入具有膜不稳定作用的肽类或蛋白，如流感病毒HA基因产物融基因肽[14]、短杆菌肽S[15]、白喉毒素及假单胞菌毒素A的跨膜区[3，16]，可使转染效率提高到10%以上，比加入复制缺陷腺病毒提高到100%低许多，但对细胞没有毒性。

　　4 提高体内基因转移效率的策略

　　外源基因在体内表达量有限和表达时间短暂是目前基因治疗中急待解决的问题之一，目前的研究包括：根据部分肝切除可刺激肝脏再生，促进肝细胞分裂和DNA合成，从而延长外源基因在体内表达时间的设想，Wu等给小鼠静脉注射外源基因与脱唾液酸糖蛋白复合物，20min后行2/3肝切除术，结果外源基因4h剩余为20%，24h为9%，7d为7%，而对照组4h为8%～12%，24 h为2%～4%，7d时已检测不到外源基因[17]；给小鼠静脉注射人血清白蛋白基因，20min后行2/3肝切除术，2周后小鼠血中人血清白蛋白达34 μg/ml，而且这一水平稳定表达4周[18]。研究发现，部分肝切除延长外源基因表达时间实际上主要是通过破坏细胞的微管系统，阻止核内体与溶酶体融合，使外源基因被溶酶体酶降解减少，从而在体内的表达时间延长。

　　Chowclhury等利用秋水仙碱破坏细胞微管系统的作用，给小鼠静脉注射秋水仙碱0.75mg/kg，30min后再注射外源基因与配体复合物，也同样达到了延长外源基因在体内表达时间的效果[19]。

　　也可利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用提高基因转染率，进而增加外源基因表达量，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因与配体复合物进行体内基因转移，检测到外源基因量比不加腺病毒组高10倍[10]。

　　5 独特优势与应用前景

　　目前的基因转移技术中，显微注射法需每个细胞操作，而磷酸钙共沉淀法、电穿孔法对细胞损害较大，这3种方法均不能在体内应用。病毒介导的基因转移效率较高，但存在病毒复制、癌基因激活风险以及携带外源基因片段长度受限的不足；脂质体介导的基因转移无明显的毒副作用，但静脉注射时易被肝、脾等网状内皮系统吞噬。这两种基因转移技术虽已用于临床，但因缺乏器官细胞靶向性，均需借助手术操作。而受体介导的基因转移安全、无毒，具有靶向性，操作简便，可类似药物体内注射，并且可以携带长达48kb的基因片段[11]，因此具有独特的优势。上述提高受体介导基因转移率和延长基因表达时间的改进措施并非都适用于体内或临床应用，但达到的效果使受体介导的基因转移呈现乐观的应用前景，如果能用一些对人体无害或有益的方法来替代上述措施，寻找到更多的象脱唾液酸糖蛋白受体具有专一性的细胞表面受体，相信受体介导的基因转移不久将能成为基因治疗中理想的基因转移技术。

参考文献

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　　2 Lee RJ et al.J Biol Chem,1996;271(14):8481

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　　7 Rojanasakul Y et al.J Biol Chem,1997;272(7):3910

　　8 Ferkol T et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(1):101

　　9 Sobolver AS et al.J Biol Chem,1998;273(14):7928

　　10 Cotton M et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89(13):6094

　　11 Goldman CK et al.Cancer Res,1997;57(8):1447

　　12 Schwerzenberger P et al.Blood,1996;87(2):472

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　　16 Uherek C et al.J Biol Chem,1998;273(15):8835

　　17 Chowclhury NR et al.J Biol Chem,1993;268(15):11265

　　18 Wu GY et al.J Biol Chem,1991;266(22):14338

　　19 Chowclhury NY et al.J Biol Chem,1996;271(4):2341