第二节载脂蛋白抗体的制备

第二节　载脂蛋白抗体的制备

　　抗原免疫动物产生的抗体是血清γ-球蛋白的一部分。抗体的理化性质及结构与γ-球蛋白相近似。γ-球蛋白是一组结构相似，但又有差异的蛋白质，通称为免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig），按其结构和免疫化学性质的差异，又可分为五类，分别称为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。载脂蛋白抗体以IgG最为稳定。因载脂蛋白的体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别，可分别采用多克隆抗体制备法和单克隆抗体制备法。

　　1．多克隆抗体的制备

　　（1）抗原

　　所知的载脂蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物，即具备有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。载脂蛋白因具备抗原特异性和免疫原性，因此可称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。抗原应该是纯化品，该纯品在12.5%的PAG电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。

　　（2）免疫

　　动物的选择：通常选择壮年、成熟且健壮的豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊、马等动物。一般多先用大白兔。作为批量生产，以采用山羊或绵羊，若需量再多，可考虑用马作为免疫动物。因动物个体差异的关系，即使是用抗原去免疫多个白兔，所得抗血清特异性会有很大的差别。因此，为了得到比较一致的抗血清，常用能产生大量抗血清的羊或马为免疫动物。

　　佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。人们公认的佐剂是福氏佐剂（Freund’adguvant），具有明显的免疫剌激作用。福氏佐剂又可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂，由羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯（arlacela）为乳剂。油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延长，从而减少加强注射的次数。在不完全佐剂内加入杀死的分枝杆菌（如结核杆菌或卡介苗）制备成完全佐剂。分枝杆菌能增加局部淋巴结的炎症反应，扩大免疫原性，从而促进最终高亲和力抗体的形成。佐剂有成品购买，也可自行制备。佐剂制备方法是，取石蜡油6份、羊毛脂4份，再加5份不含抗原的抗原缓冲液（含0.1%SDS）,混匀，灭菌，分装于小玻璃瓶中，0～8℃保存，此为不完全佐剂。在不完全佐剂中加入卡介苗（3～5mg/0.5ml）即为完全佐剂，均贮存于0～8℃。临用时，取完全佐剂3份加入含抗原的缓冲液1份，混匀，振摇或研磨，使其成为乳化状态，因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每兔（约2kg重）或每羊（约20kg重）第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。

　　免疫途径及方法：免疫部位可分别选用皮内、皮下或淋巴结。第1次免疫采用皮内结合皮下多点注射，常注射在背部或腿部。许多作者介绍在后足蹠皮下或皮内注射，因为四足落地的关系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使动物行走不便，造成伤害。整个免疫过程以2～3个月为宜。一般是第1次免疫后的3～4周再进行第2次免疫，不完全佐剂为乳化剂。2周后加强1次（不完全佐剂），2周后又加强1次（不完全佐剂或完全佐剂），1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7～10天，取静脉血测试抗体效价（试血），效价达到要求后即可一次性放血，采用颈动脉放血，得抗血清。笔者采用此法先后免疫成功ApoAⅠ、AⅡ、B₁₀₀和E的抗血清。

　　（3）抗血清的保存

　　免疫成功的动物放血过程，所有用具均严格消毒，并按无菌操作方式进行放血。抗血清的防腐剂以0.05%叠氮钠为宜；也可采用加入20%～30%无菌甘油保存的方法。若时间较长，不用可采用-20℃低温保存。一般在0～8℃保存1年，抗体效价几乎无改变，保存2年，其效价稍有降低。抗体切忌反复冻融，否则抗体效价很快降低，以颈动脉一次性放血为宜。

　　2．单克降抗体的制备

　　单克隆抗体是一种高度特异性的抗体。单克隆抗体与多克隆抗体有一定的差别。抗体含量比较，单克隆抗体浓度高，腹水中可达0.5～10mg/ml，而多克隆仅0.1～1.0mg/ml；结合特性，单克隆抗体仅与单个抗原决定簇结合，特异性和亲和力高，多克隆抗体可与所有抗原决定簇结合，特异性和亲和力比较差；含免疫球蛋白类型，单克隆抗体仅一种亚类，多克隆抗体为所有种类和亚类。单克隆抗体在腹水中含量较高，可以人工培养，专一性强等特性是多克隆抗体无法比拟的优点。

　　（1）单克隆抗体产生机理

　　单克隆抗体制备过程中需要两种细胞和即骨髓瘤细胞和脾细胞。骨髓瘤细胞是一种恶变细胞，在体外有无限的增殖能力，并能分泌很多化学结构均一的免疫球蛋白，但特异性很差，当它与不同性质的动物脾细胞融合时，可形成杂交瘤细胞株。该细胞株在HAT培养基（内含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶）中生长良好，而骨髓瘤细胞则在HAT培养基中不能生长。因为①缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，不能利用次黄嘌呤合成嘌呤；②氨基喋呤可阻止细胞内嘌噙和胸腺嘧啶的合成。经免疫的动力脾细胞，不能在体外增殖，但是能产生相应的特异抗体，可以与骨髓瘤细胞融合，并形成可分泌单克隆抗体的细胞株。

　　操作过程，一般是先把骨髓瘤细胞和经免疫的脾细胞置在聚乙二醇（PEG）中进行融合，然后在HAT培养液中选择培养，由此得到杂交瘤细胞，采用有限稀释法，即能把产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株筛选出来。该细胞再经人工培养，或注射到小鼠体内等亚克隆方法，即可得到单克隆抗体。

　　（2）操作：以ApoAⅠ为例。①免疫小鼠：取ApoAⅠ500μg注射入小鼠腹腔内，抗原以1：1的比例溶于完全福氏佐剂中乳化。每2～3周追加一次1：1不完全福氏佐剂抗原混合物，共3次。一般1次接种5～10只小鼠。从每只小鼠尾静脉或眼眶取血，采用ELISA方法或单向免疫扩散法鉴定抗体效价，用作鉴定的鼠血清至少按1：2000稀释。在取出小鼠脾脏之前3天应该再静脉注射一次抗原以提高其效价；②培养骨髓瘤细胞：取HGPRT^-骨髓瘤细胞，经HAT培养液培养，并取对数生长的细胞（细胞死亡数＜5%）供融合使用；③制备脾细胞：将接种免疫成功的小鼠脾脏取出（无菌操作），放入装有5ml冷水的不含血清DMEM（高葡萄糖）液中，匀浆，直至成为单细胞悬液（约10⁸细胞），将脾细胞移入到一个50ml有盖管内，冰水中静置5分钟，待碎片沉淀后，将上清液移出。离心，NH₄Cl缓冲液溶解脾细胞中的红细胞，得到脾细胞悬液（无红细胞）；④细胞融合（杂交）增殖：取瘤细胞（10⁷）与脾细胞（6×10⁷）混合，再洗1次，制备双份，分别用40%PEG1000（pH8.0）进行融合，离心沉淀，于沉淀细胞中加RPM1-1604完全培养液稀释。取此稀释液0.5ml分别加到含腹腔细胞（HGPRT^-小鼠）的24孔板的每一孔穴中，置于37℃温箱中，次日吸出0.5ml上清液，加入HAT溶液0.5ml。如此连续操作两天，以后每隔2～3天重复1次，半月后改换HT培养液，再过半月后，改用RPM1-1604完全培养液，均处于37℃环境；⑤单克隆抗体细胞株筛选；当杂交瘤细胞长满孔穴的1/3时，即可对培养液中的抗体检测，连续2次呈阳性孔穴，要立即克隆到预先加腹腔细胞（10⁴/孔）的96孔板中，每孔含有一个杂交瘤细胞，一般经3～4天后克隆细胞开始增殖。接着再挑出阳性孔穴进行克隆，样得到的上清液即为单克隆抗体；⑥杂交瘤细胞腹水单克隆抗体的制备：取0.5ml Pristane（2，6，10，14-四甲基十五烷）液注射入HGPRT^-小鼠腹腔内，7～15天后，取0.5×10⁶～1.0×10⁶杂交瘤细胞以同一途径进行注射，15～30天后可以收集腹水5～10ml，抗体效价显著增高；单克隆抗体制备过程如图18-1所示；⑦细胞株的保存：于保存管中加入0.5～1.0ml保存液（含10%二甲基亚砜的小牛血清液）10⁶杂交瘤细胞株，置聚乙烯塑料盒。-40～-80℃过夜，尔后移至液氮罐保存。

图 18-1 单克隆抗体的制备（源自：Goding JW.1987）

　　(3)抗体的检测

　　抗体检测可分别采用免疫火箭电泳法、单向扩散法、免疫电泳法、ELISA法、免疫透射比浊法和放射免疫沉淀法。