第三节单向免疫扩散法

第三节　单向免疫扩散法

　　一、原理

　　将抗载脂蛋白血清均匀地混合于琼脂糖凝胶内，打孔，加样。孔中待测样品的抗原辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原Apo含量成正比。

　　二、试剂

　　1.0.05mol/L pH8.2巴比妥钠-HCl缓冲液；巴比妥钠15.8g加水至1000ml。以1.17mol/l HCl调pH至8.2，约1.17mol/L Hcl（浓HCl 19.3ml加水180.7ml）18.36ml，最后以蒸馏水补足至1421.8ml。

　　2．24.0g/L琼脂糖：优质琼脂糖粉2.4g，硫柳汞0.01g，加0.05mol/l pH8.2巴比妥钠HCl缓冲液100ml，加热融化后，根据浇注板的大小分装，每管5.8ml、3.4ml、1.5ml，加塞后4℃或室温保存。

　　3．0.1g/L硫柳汞生理盐水：1000ml生理盐水中含硫柳汞0.1g。

　　4．抗血清：临用前根据浇注板的大小，按效价稀释。

　　三、操作

　　1．浇注琼脂糖凝胶板

　　取“凹”型有机玻璃框架，厚1.6mm，两边夹6×12cm玻璃，再用铁夹夹紧玻璃待用。

　　加热融化24.0g/L琼脂糖，56℃水浴保温。根据抗Apo血清效价，按表18-19进行配制。

表18-19 含抗血清琼脂糖板配制法

　　将稀释的抗血清倾入已融化的琼脂糖中，颠倒混匀1～2次，避免产生气泡，迅速浇注预置水平位置的双层玻板内，待凝。抗血清效价高时，亦可直接将抗血清混入12.0g/L琼脂中，摇匀后制板。

　　2．按模式图用直径3mm的金属管打孔，6×12cm免疫扩散板打孔28个，6×8cm免疫扩散板打孔16个。

　　3．待测血清用硫柳汞盐水稀释（按说明书），用微量加样器每份标本加1孔。加样量10μl。置湿盒（水平位置）37℃扩散24h，测沉淀环直径，如图18-2所示。

图18-2　单向免疫扩散图（0.8％琼脂糖）

　　4． 标准曲线的制备（参考方法）

　　（1）参考血清稀释法：取Apo含量标准参考血清用盐水稀释成梯度浓度。ApoAⅠ：20、40、60、80、100mg/dl，同上法操作加样，每一稀释浓度应在两块板的不同位置各加样孔，每孔5μl。37℃湿盒扩散24h，测沉淀环直径，求出各稀释度均值。制作标准曲线。

　　（2）用半对数纸制作：以抗原含量为纵坐标（对数），沉淀环直径为横坐标，在半对数纸上作图。一般要求至少有4个不同稀释度。增加标准曲线上的点数；可增加其可靠程度。

　　（3）用推算平均值法制备标准曲线：RID定量法尽管严格遵守所有的试验条件，但不同浓度所求得的沉淀环直径，在绘制曲线时仍然常不在一条直线上，推算平均值法是通过数学方法处理，使不在标准曲线上的各点回归到同一直线上来。可用公式log y=ax＋b表示。

　　结果判断

　　根据待测血清在含抗Apo血清免疫扩散板上形成的沉淀环直径，查标准曲线即可行相应Apo的含量。可以mg/dl报告，也可以国际单位报告（g/L）