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第十八章 血清载脂蛋白的免疫测定 血浆中蛋白质种类繁多，对各种单一蛋白进行快速而又特异的定量。公认的方法是免疫测定法，即利用其特异的抗体，采用测定抗原抗体复合物的方式定量。血浆（清）中载脂蛋白是以脂蛋白形式存在的少量蛋白，在解联剂作用下，使载脂蛋白从脂蛋白中分离出来，再利用相应的载脂蛋白抗体进行测定。 载脂蛋白的免疫测定方法很多，目前采用的方法各有其特点，所需条件也有差异，现将医学检验中常用的定量方法作一简要介绍。 第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价 一、载脂蛋白测定方法 1．单向免疫扩散法（radial immunodiffusion,RID） 该法较简单，一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清，扩散过程至少24h，最多需72h，测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单，应严格控制有关条件如：含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀；加入小孔的稀释抗原（血清）量要准确；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一，如琼脂糖凝胶浓度在1.5%～2.0%,可能仅测出LDL的ApoB，大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出，因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外，扩散过程中，凝胶板一定要水平，否则易使扩散环呈椭圆形，难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5～10.0mm为宜，应在两个方向测量直径，其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值，测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。 2．电免疫测定法（electroimmunoassay,EIA） 该法灵敏，抗血清用量少，如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其电泳时间可缩短一倍，火箭峰高以1～4cm为宜，火箭峰的测量可以计算面积或峰高，峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml，又称为火箭电泳法。 3．免疫比浊法(immunoturbidimetry assay,ITA） 简便快速，在自动分析仪进行操作并能批量检测，是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种：一是测定光散射的，又名免疫散射比浊法（INA）；需用特殊的激光浊度仪；另是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度，称为透射免疫比浊法（ITA），其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定，速率法是根据散射光强度与时间的关系，以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度，后者与溶液中抗原量成正比，常可在1min内完成测定过程，可自动扣除空白；终点法比速率法稳定，一般多用终点法。 4．酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定，可测出ng级水平的抗原或抗体含量，该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。 5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA） 该法灵敏，抗血清用量少，所需设备较多，一般用125I标记抗原作为示踪物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸）以外，都可以作碘标记（氯胺T法），以双抗体法测定RIA法可检测最低至3～5ng。临床检验中不常用此法，主要用于动物实验的科学研究工作。 还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。 血清载脂蛋白测定的方法，从测定原理、方法学评价及参考值，刘秉文和李健斋等人作了大量的工作，为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清，其后，国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并广泛应用于临床的疾病诊断，在部分大医院已成为常规检查项目。 刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值，本节将引用如下比较表： 表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P，M P，M P P，M P P 灵敏度（n） 0.3～10 0.1～0.5 100 100 150 100 测定范围（ng） 1～200 0.5～15 100～500 200～800 200～500 200～600 批内CV（%） 3～9 4～8 3～5 6 3～7 1 批间CV（%） 5～10 8～10 3～9 10 6～7 6 正常值（g/L） 1.0±0.2 1.5±0.2 1.2±0.2 1.2±0.1 1.2±0.2 1.7±0.2P:多克隆抗体；M：单克隆抗体；RIA：放射免疫法；ELISA；酶联免疫法；RID：单向免疫扩散法；INA：免疫散射比浊法；ITA：免疫透射比浊法。 （源自：刘秉文，1995.） 表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P P，M P P P P 灵敏度（g） 0.5 20 5 30 20 测定范围（ng） 1～20 5～50 30～60 50～400 50～900 40～150 批内CV（%） 7 8 5 5 5 5 批间CV（%） 9 7 8 - 7 6 正常值（g/L） 0.25±0.4 0.35±0.05 0.76±0.2 0.29±0.02 0.37±0.09 0.36±0.03（源自：刘秉文，1995.） 表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA 抗体 P P P 灵敏度（g） 5 0.2 20 测定范围（ng） 5～50 0.5～8 50～200 批内CV（%） 5 3.60 5 批间CV（%） 7 8 9 正常值（g/L） 0.17±0.03 0.14±0.05 0.14±0.04（源自：刘秉文，1995.） 表18-4 ApoB100免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P，M P，M P P，M P P 灵敏度（n） 5～10 2～20 50～300 300 300 300 测定范围（ng） 0～100 2～10 20～500 50～600 300～500 100～500 批内CV（%） 4～8 4～7 1～7 3～7 4～7 2 批间CV（%） 7～11 10 3～10 6～7 7～8 2 正常值（g/L） 0.9±0.2 0.85±0.1 0.6±0.3 0.8±0.2 0.8±0.2 0.8±0.3（源自：刘秉文，1995.） 表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较 RIA ELISA INA 抗体 P P P 灵敏度（n） 1 5 50 测定范围（ng） 5～30 15～100 - 批内CV（%） 7 3 5 批间CV（%） 9 5 8 正常值（g/L） 0.05±0.03 0.06±0.002 0.06±0.01（源自：刘秉文，1995.） 表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA RID ITA 抗体 P P P P P 灵敏度（g） 10 0.3 45 40 10 测定范围（ng） 10～80 0.5～5 70～600 40～600 12～50 批内CV（%） 6 3 6.5 2.1 3.3 批间CV（%） 10 8 8.2 3.9 6.2 正常值（g/L） 0.04±0.01 0.033±0.008 0.04±0.002 0.039±0.017 0.04±0.01（源自：刘秉文，1995.） 表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P P P P P P 灵敏度（g） 1 0.3 10 76 20 15 测定范围（ng） 2～20 1～6 20～80 76～600 50～400 30～120 批内CV（%） 13 4.3 8 2.5 6.3 5.2 批间CV（%） 13 4.3 8 3.5 6.3 5.2 正常值（g/L） 0.15±0.06 0.16±0.03 0.12±0.04 0.127±0.037 0.12±0.03 0.11±0.03（源自：刘秉文，1995.） 二、人血浆（清）载脂蛋白参考值比较 刘秉文于1995年对国人血浆（清）各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较，其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。 表18-8 ApoE免疫测定法的比较 RIA ELISA EIA RID ITA 抗体 P P，M P P P 灵敏度（n） 0.2～8 0.5 20 35 5 测定范围（ng） 0.8～100 0.5～6 20～200 50～300 20～400 批内CV（%） 6 4 8 5.9 2 批间CV（%） 9 8 5 7.2 5 正常值（g/L） 0.05±0.02 0.04±0.01 0.10±0.04 0.035±0.01 0.04±0.01（源自：刘秉文，1995.） 表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较 作者 发表时间 方法 例数 性别 年龄 均值±s（mg/dl） 张祖辉 1998 RID 307 男 20-77 122.1±13.7 刘秉文 318 女 20-77 125.5±15.9 李键斋等 1986 EIA 291 男+女 19-50 119±17 周新等* 1990 EIA 692 男 13-85 129.1±16.1 477 女 18-80 130.5±14.2 Albers等 1976 RID 20 男+女 11.5±7.3 115.7±7.3 Cheung等 1977 RID 172 男 20-65 120±20 188 女 20-65 135±25 Reman等 1978 RID 95 男 40-49 137±23 104 女 40-49 137±23 Schonfelcl等 1974 RIA 41 男 13-58 100±35 34 女 16-58 104±34 Karlin等 1976 23 男 20-39 130±3 19 女 20-39 154±6 Avogaro等 1978 EIA 60 男 20-60 128±22 60 女 20-60 134±20 Mordasini等 1980 EIA 50 男 20-60 113±9 50 女 20-60 125±17 Miller等 1980 EIA 8 男 34-70 122±27 8 女 52-68 149±20 Rosseneu等 1981 IAN 12 男 29 139±15 14 女 30 147±24 Assmann等 1982 INA 3032 男 20-65 136±23 1367 女 20-60 146±25（源自：刘秉文，1995） *：作者补充。 表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较 作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s（mg/dl） 罗静聪 1988 RID 76 男+女 26.7±4.6 刘秉文 1988 ELISA 41 男+女 24.2±5.9 胡维诚 1987 RID 160 男+女 27.0±4.4 Curry等 1976 RID 19 男 78.0±1.7 19 女 83.0±25 Cheung等 1977 RID 172 男 33.0±5 188 女 36.0±6 Assmann等 1977 EIA 15 男 34.1±5 15 女 38.3±5.5 Schonfeld等 1977 RLA 29 男+女 40.5±8.9 Maupovic等 1981 ELA 50 男+女 68.0±18 Goldberg等 1980 RIA 50 男 25.0±1 50 女 26.0±1 De Backnev等 1982 INA 70 男+女 43.0±6.9 Zech等 1983 RID 27 男+女 24.0±0.6 Noma等 1983 RLA 27 男+女 32.0±8.3 Nukita等 1984 EIA 156 男+女 40.0±9（源自：刘秉文，1995） 表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较 作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s（mg/dl） 周新等 1986 EIA 608 男 83.2±13.9 511 女 80.4±13.4 李健斋等 1986 EIA 727 男+女 76±19 吴兆丰、刘秉文 1987 RID 304 男 87.9±14.4 320 女 86.7±14.4 Albers等 1975 RIA 349 男+女 81.0±20 Bantorich等 1975 RIA 82 男+女 90.0±24 Bedford等 1976 RIA 128 男+女 87.0±30 Schonfeld等 1974 RIA 42 男+女 83.0±16 Brussaard等 1980 EIA 60 男+女 63±16 Fruchart等 1981 EIA 144 男+女 90 Curry等 1978 EIA 38 男 90±2.0 36 女 88±11 Curry等 1978 RID 20 男+女 87±26 Lees等 1970 RID 64 男+女 83±25 Snuderman等 1975 RID 31 男 82±22 Fievet等 1979 INA 206 男 129±31 271 女 120±34 Heuck等 1979 INA 68 男+女 82.0±23 Rossenue等 1981 INA 70 男 92±13 Durrington等 1976 INA 29 男+女 85±11（源自：刘秉文，1995） 表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较 作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s（mg/dl） 傅明德等 1987 ELISA 202 男 7.6±2.5 214 女 8.0±2.3 Polz等 1980 RID 10 男+女 6.9±2.0 Curry等 1981 ELA 68 男+女 6.0±1.5（源自：刘秉文，1995） 表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较 作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s（mg/dl） 傅明德等 1987 ELISA 202 男 5.2±1.9 241 女 4.9±1.8 范萍等 1989 RID 67 男+女 3.9±1.7 Schonfeld等 1979 RIA 93 男+女 3.9±1.4 Curry等 1981 EIA 68 男+女 4.0±2.0 Kashyap等 1977 RIA 32 男+女 5.0±0.4（源自：刘秉文，1995） 表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较 作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s（mg/dl） 傅明德等 1988 ELISA 134 男 11.6±3.6 135 女 12.0±3.7 范萍等 1989 RID 67 男+女 12.7±3.7 刘秉文等 1987 IRA 21 男+女 9.2±2.1 Schonfeld等 1979 RID 93 男+女 15.4±6.2 Curry等 1980 ELA 54 男+女 10.9±3.0 Kashyap等 1981 RIA 29 男+女 11.1±0.9（源自：刘秉文，1995） 表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较 作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s（mg/dl） 刘铭锋、刘秉文等 1987 ELISA 42 男+女 3.57±1.24 刘铭锋、刘秉文等 1987 ELA 50 男+女 4.70±1.18 刘铭锋、刘秉文等 1992 RID 116 男 3.95±0.98 122 女 4.00±1.32 张东升、夏辉明 1991 ELISA 25 男+女 3.45±1.24 Blum等 1980 RIA 26 男+女 3.6±1.3 Gregg等 1984 RIA 12 男+女 4.8±1.2 Wesgraber等 1984 RIA 男+女 5(3.5-7.0)（源自：刘秉文，1995） 王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数，如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外，并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录，供参考。 表18-16 血脂与脂蛋白水平（mmol/L） 项目 男（225例） 女（58例） P值 TC 4.87±0.73 5.16±0.84 ＜0.05 TG 1.27±0.66 1.25±0.71 ＞0.05 HDL-C 1.41±0.35 1.54±0.36 ＜0.02 HDL2-C 0.56±0.17 0.63±0.19 ＜0.02 HDL3-C 0.86±0.23 0.91±0.19 ＞0.05 LDL-C 2.95±0.68 3.13±0.12 ＞0.05（源自:王抒，1996） 表18-17 几项常用比值* 项 目 男 女 LDL-C/HDL-C 2.21±0.72 2.16±0.80 HDL2-C/HDL3-C 0.66±0.12 0.69±0.15 ApoB/ApoAⅠ 0.72±0.16 0.74±0.17 ApoAⅠ/ApoAⅡ 4.10±0.65 4.10±0．68 ApocⅡ/ ApoCⅢ 0.39±0.12 0.41±0.16男女组间无显著意义 （源自：王抒，1996） 表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数 项目 X±S p5 p25 p50 p75 p95 男（225例） ApoAⅠ(g/L) 1.42±0.17 1.17 1.30 1.43 1.51 1.72 ApoAⅡ(g/L) 0.36±0.66 0.28 0.32 0.35 0.40 0.46 ApoB(g/L) 1.01±0.21 0.72 0.86 1.00 1.14 1.38 ApoCⅠ(mg/L) 53±17 31 43 50 60 83 ApoCⅡ(mg/L) 34±16 13 24 31 42 69 ApoCⅢ(mg/L) 44±17 26 34 41 51 74 ApoE(mg/L) 44±17 26 34 41 51 74 Lp(α)(mg/L) 144125 26 53 107 185 382 女（58例） ApoAⅠ(g/L) 1.45±0.14 1.21 1.34 1.44 1.55 1.74 ApoAⅡ(g/L) 0.36±0.06 0.26 0.33 0.36 0.39 0.44 ApoB(g/L) 1.07±0.23 0.71 0.90 1.08 1.20 1.49 ApoC(mg/L) 53±18 30 39 51 61 92 ApoCⅡ(mg/L) 41±18 20 28 38 49 77 ApoCⅢ(mg/L) 104±40 52 72 100 129 184 ApoE(mg/L) 51±18 33 37 48 58 89 Lp(α)(mg/L) 154±116 35 66 117 207 464国内的已有报道表明，人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起种差异的原因是多方面的，认为主要原因有：①检测方法与仪器不同；②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一；③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清；④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立，尚需付出艰辛的劳动。 |
