冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程

冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程

　　本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鲜血浆分离、提纯、冻干并经病毒灭活制成。主要成份为人凝血因子Ⅷ及少量纤维蛋白原，含适量枸橼酸钠，不含防腐剂。本品对缺秒人凝血因子Ⅷ所致的凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病的出血症状。

　　1 制造

　　1.1制造要求

　　1.1.1 对血浆的要求

　　1.1.1.1所用之血浆来源应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》要求，血浆应无凝块、无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。在采集时应减少皮肤损伤，保持血流通畅，并与抗凝剂充分混合，用塑料袋采集。新鲜分离液体血浆或新鲜冰冻血浆及冻结冷沉淀，均可用于生产。

　　1.1.1.2分离后的血浆应保持无菌，并应及时冰冻保存。自采血到冻结一般在8小时内完成。液体血浆应在4±2℃贮放，贮放时间应不超过小时，最长不得超过12小时。冰冻血浆（-30℃以下）保存期不超过6个月。

　　1.1.2 对制造工作室、设备及原材料的要求，与《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.1.3～1.1.4项要求相同。

　　1.2 制造工艺

　　1.2.1 采用低温乙醇法或冻融法制得冷沉淀，经抽提、吸附、精制，亦可采用经卫生部批准的其他工艺制备，并经卫生部批准的适宜方法进行病毒灭活处理。

　　1.2.2 分批

　　同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批，不同滤器和不同机柜冻干的制品分为亚批。

　　1.2.3 稳定剂及防腐剂

　　制品内允许加稳定剂，制品应不含防腐剂。

　　1.2.4除菌过滤及分装

　　本品应用微孔薄膜过滤，可直接分装无菌的成品瓶内，每瓶装量根据效价及规格确定。

　　1.2.5 半成品检定

　　每批半成品应进行效价测定及热原质试验，并按亚批做无菌试验。

　　1.2.6 冻干

　　除菌过滤分装的制品经外观检查后立即冻结，并按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》1。2。5项规定进行冻干，但制品温度不得超过35℃。

　　1.3 规格

　　每瓶含人凝血因子Ⅷ的效价可有50、100、200、300、400IU五种，制品的效价应标示在瓶签及包装上。

　　2 成品检定

　　2.1抽样

　　每批制品应抽样作全面质量检定，不同机柜冻干的制品分别抽样做无菌试验和水分测定。

　　2.2 物理检查

　　2.2.1 外观

　　应为乳白色疏松体，无融化迹象。溶解后溶液澄清或轻微乳光，允许有微量细小蛋白颗粒。

　　2.2.2 真空度

　　以高频火花真空测定器检测，瓶内应出现蓝紫色辉光。

　　2.2.3 溶解时间

　　从冰箱取出的制品应先平衡至25～37℃，然后按瓶签标示量加入适量30～37℃灭菌注射用水，使其每ml含4IU。制品应于30分钟内溶解。

　　2.3 化学检定

　　按《生物制品化学检定规程》进行。

　　2.3.1 水分

　　水分含量应≤3%（g/g）。

　　2.3.2pH值

　　取2.2.3项下溶解在20±2℃测定，pH值应为6.8～7.6。

　　2.3.3 钠离子测定

　　取2.2.3 项下溶液测定，钠离子含量应≤160mmol/L。

　　2.3.4枸橼酸离子测定

　　取2.2.3项下溶液测定，如加枸橼酸钠作稳定剂，其枸橼酸离子含量应≤25mmol/L。

　　2.4 效价测定

　　取2.2.3项下溶液用一步或二步法（见附录）进行测定，每瓶所含人凝血因子Ⅷ的效价应不低于标示量的80%。

　　2.5 比活性

　　每mg蛋白质所含人凝血因子Ⅷ的效价应≥0.25IU。

　　2.6HBsAg检测

　　用敏感性为1ng/ml以下的试剂盒检测，应为阴性。

　　2.7 抗HCV检测

　　用敏感的方法检测，应为阴性。

　　2.8抗HIV-1及2检测

　　用敏感的方法检测，应为阴性。

　　2.9 无菌试验

　　样品溶解后按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　2.10 安全试验

　　2.10.1 豚鼠试验

　　用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品15IU，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。

　　2.10.2 小白鼠试验

　　用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射检品1.5IU，半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠复试一次，判定标准同前。

　　2.11 热原质试验

　　按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量按家兔体重注射10IU/kg。判定标准按该4.2项要求进行。

　　2.12 鉴别试验

　　用免疫双扩散法，仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛血清不产生沉淀线。

　　2.13根据病毒灭活方法，必要时应增加相应的检定项目。

　　3 保存与效期

　　应严格保存于10℃以下避光干燥处，运输期间亦应冷藏。效期自效价检定合格之日起为2年。

　　附录1人凝血因子Ⅷ效价测定（一步法）

　　1 试剂

　　1.1样品稀释液：取1容积的3.8%枸橼酸钠液加入5容积咪唑缓冲液。

　　1.1.1 咪唑缓冲液

　　称0.68g咪唑和1.17g氯化钠溶于100ml蒸馏水中，加入42.2ml 0.1mol/L盐酸，然后被 加入蒸馏水至200ml,pH为7.3。

　　1.1.23.8%枸橼酸钠溶液

　　称9.5g枸橼酸钠溶解于250ml蒸馏水中。

　　1.2 血小板代用品“兔（人）脑组织的氯仿抽提液”。用前用生理盐水稀释至适当倍数。

　　1.3白陶土生理盐水混悬液

　　称0.5g白陶土加生理盐水至100ml即可使用。

　　1.4 基质血浆

　　取人凝血因子Ⅷ含量低于2%的血友病病人血浆或人工基质血浆，然后分装于5ml安瓿，冻干或-30℃保存。

　　1.50.05mol/L氯化钙溶液

　　称111g氯化钙溶于1000ml蒸馏水中，配制成1mol/L氯化钙贮存液，用前进行20倍稀释，配成0.05mol/L氯化钙溶液。

　　1.6 人凝血因子Ⅷ标准品及标准血浆

　　人凝血因子Ⅷ国家标准品或经国家标准品标化的工作标准（定量分装冻干，置-30℃保存，一般2IU/ml左右），用前取样品稀释液溶解成1IU/ml。

　　标准血浆系取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小瓶内，置-30℃保存。自采血后至分浆冻结整个过程不得超过4小时。

　　1.7待测样品

　　按标示量加入注射用水溶解，测定时稀释成1IU/ml。

　　2 测定

　　2.1取2支试管，每管加入0.1ml基质血浆和0.1ml样品稀释液，混匀，再加0.1ml血小板代用品和0.1ml白陶土悬液，混匀，将试管置37℃水浴保温一定时间（一般2～6分钟），然后加入0.1ml0.05mol/L氯化钙溶液，记录凝固时间，2管平均值为基质血浆的“空白”值（一般应大于3分钟）。

　　2.2 标准品或标准血浆

　　用样品稀释液分别进行10倍、20倍、40倍、100倍和200倍稀释，用不同稀释浓度标准品代替2.1项试验中样品稀释液，按上述方法分别测定凝固时间。

　　2.3 待测样品稀释成约0.02～0.04IU/ml，代替2.1项试验中样品稀释液，同时分别测定凝固时间。

　　2.4测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。

　　3　计算

　　将标准品5个不同稀释度所含人凝血因子Ⅷ单位（IU/ml），分别取其对数值，再将其各相应浓度所测得凝固时间（秒），也分别取对数值，然后按照统计学方法作直线回归方程。

　　方程式：log y=b olg x+a

　　其中x代表人凝血固子Ⅷ单位数，y代表测得相应凝固时间（秒）。

　　将测试样品所得到凝固时间（秒）代入方程式计算x值。然后将所得x值乘以样品稀释的倍数，即为每ml中人凝血因子Ⅷ含量。

　　附录2 人凝血因子Ⅷ效价测定（二步法）

　　1 材料

　　1.1试剂

　　1.1.10.05mol/L CaCl2溶液

　　称7.35gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。

　　1.1.20.025mol/L CaCl2溶液

　　称3.675gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。

　　1.1.3 咪唑缓冲液

　　称0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于约100ml蒸馏水中，加37.2ml0.1mol/l HCl，加蒸馏水至200ml，pH为7.3～7.4。

　　1.1.4 枸橼酸盐-氯化钠溶液

　　1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。

　　1.1.5Al(OH)3胶

　　a称（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63℃蒸馏水中。

　　B称氨明矾19.175g，溶于250ml58℃的蒸馏水中。

　　C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸馏水。

　　三种溶液配毕后，立即将c液迅速倒入a液中搅匀，然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液，用力搅拌10分钟（保持温度不低于58℃），离心（2500r/min，15分钟），弃上清，沉淀洗涤5次。

　　第一次：用75ml蒸馏水加0.055ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。

　　第二次：用75ml蒸馏水加0.11ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。

　　第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。

　　将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中，混匀，分装，4℃保存。

　　1.1.6 正常人血清

　　分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37℃保温5～6小时，置4℃冰箱过液，分离血清，混匀，定量分装（0.5ml/安瓿），冷冻干燥，-20℃保存。

　　用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，然后用咪唑缓冲液作1∶10稀释，4℃冰箱过夜（使血清活化），试验当日再用咪唑缓冲液作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。

　　1.1.7 牛Ⅴ因子

　　收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中，室温放置4小时，离心（2500r/min，30分钟），分离血清，取血清加10%（g/ml）BaSO₄在室温下搅拌吸附40分钟，离心（2500r/min，40分钟），弃沉淀，定量（1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。

　　用时取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，用生理盐水作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。

　　1.1.8 磷脂

　　取新鲜脑（人，牛，兔），除去表面血管、脑膜，尽可能除去白质，切成薄片，称重，轻轻捣碎，用3倍脑组织的丙酮提取5次，每次用双层绸布滤干，最后脑粉于37℃干燥1小时，称取脑粉1g，加20ml氯仿提取，于室温振摇2小时后，用单层滤纸过滤，滤液放抽气柜内用吹内机吹至微干，加10ml生理盐水研制成白色均匀乳状液，定量（0.1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。

　　用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解后，用盐水作最适浓度稀释（一般为1∶100～1∶500），置冰浴备用。

　　1.1.9 基质血浆

　　正常枸橼酸血浆，按3ml分装，-20℃保存。

　　1.2标准品和样品。

　　2 操作

　　2.1试剂混合

　　取稀释人血清、Ⅴ因子、磷脂等量混合，置冰浴30分钟后备用。

　　2.2标准品、样品的准备和稀释

　　2.2.1 若试验血浆对标准血装（标准血浆为未吸附者）：二者按1ml血浆加0.1ml Al(OH)3悬浮液混合，置37℃水浴吸附3分钟，离心取上清备用。

　　2.2.2 试验血浆对浓缩标准或试验浓制品对标准血浆：用Ⅷ因子严重缺乏的血浆（Ⅷ因子含量＜1%）稀释浓缩标准品或试验浓制品使成0.5～1.0IU/ml，然后按2.2.1法进行吸附处理。

　　2.2.3浓缩试验品对浓缩标准品：直接溶解稀释成0.5～1.0IU/ml。

　　2.2.4标准品和检品准备好后，立即用枸橼酸盐一氯化钠溶液分别作3个连续倍倍稀释，使最低和最高稀释度的凝结时间在17～35秒间（一般为1∶16～1∶256）

　　2.3 测定

　　2.3.1 第一步，混合物的保温

　　取7支玻璃凝集管放入冰浴中，每管加0.3ml混合试剂，然后于第1、2、3管分别加高、中、低稀释度的标准品各0.1ml，第4、5、6管分别加高、中、低稀释度的样品各0.1ml，第7管加枸橼酸盐-氯化钠溶液0.1ml（作空白）；从第1管开始逐管移入37℃水浴，加0.05mol /L预温CaCl2溶液0.1ml，混匀，记时。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的时间间隔均为1分钟。

　　2.3.2 第二步，凝血酶原激活物生成量的测定（取样时间以15分钟和21分钟为例）

　　另取13支凝集管，每管各加入0.025mol/l CaCl₂溶液0.2ml，当第一步第1管保温至12分钟时，将此13支凝集管和1支装有基质血浆的试管放入37℃水浴中，待混合物保温至14分钟40秒时，从第1保温管中取出0.1ml混合物加到1支含有0.025mol/l CaCl₂溶液的凝集管中，于15分钟时，加入0.2ml基质血浆混匀，另用一只秒表记录从基质血浆加入到纤维蛋白形成所需的时间（纤维蛋白形成可用肉眼观察，也可用仪器测量），其余各管每隔1分钟如此依次进行，并于第21～26分钟作第二系列测定，两系列所测得凝结时间不应相差5%（说明稳定的凝血酶原激活物已形成，否则保温时间应调整）。空白管于第27分钟时取样测定。

　　为了消除试验顺序误差，将标准品和样品的试验顺序改变，2.3.1及2.3.2项过程重复一次。

　　2.4 计算

　　2.4.1 作图法

　　用双对数纸，以凝结时间（秒）为纵坐标，稀释度（如25%、50%、100%……）为横坐标，分别将标准品和样品两套试验结果的平均凝结时间作两条平行线，从100%含量的稀释度处作一垂直线与试验线相交，通过交点作一水平线与标准线相交，再通过交点作一垂直线与横坐标相交，其交点读数即为试验样品相当于标准品的百分含量。若标准线和试验线的直线性、平行关系有显著性差异，或空白试验小于40秒，则分析结果无效。

　　2.4.2 用3.3平行线法公式计算

　　样品效价（IU/ml）=log-1（I·V/W）标准品效价·样品稀释倍数×D值

　　I=0.301(2倍系列稀释法的常数)

　　V=1/3（T1+T2+T3－S1―S2―S3）

　　T1、T2、T3为样品3个倍倍稀释度的凝固时间（秒）

　　S1、S2、S3为标准品3个倍倍稀释度的凝固时间（秒）

　　若V为负值，变为正值后再代入上面公式计算，若V为正值，变成负值后再代入上面公式计算。

　　W=1/4（T3－T1＋S3－T1）

　　D值=标准品的最大稀释度/样品的最大稀释度

　　3 注意事项

　　3.1因Ⅷ因子易变不稳定，因此在进行标准品和样品的稀释时，应快而准确，稀释后立即检定，冰浴中不得放置30分钟以上。

　　3.2试验中各试剂的最适稀释度和混合物保温时间随试剂的变化而异，故应作试验预测，稀释试剂应在冰浴中放置，使用时间超过半天应重新配制。

冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂使用说明书

　　本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鲜血浆分离、提纯、经病毒灭活、冻干制成。主要成份为人凝血因子Ⅷ及少量纤维蛋白原，含适量稳定剂，不含防腐剂，为乳白色疏松体。本品对缺少凝血因子Ⅷ所致的凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。

　　用法

　　本品专供静脉输注，应在临床医师的严格监督下使用。用前应先以30～37℃灭菌注射用水或5%葡萄糖注射液按瓶签的标示量注入瓶内（制品刚从冰箱取出或在冬季温度较低时应特别注意使制品温度升高到26～37℃，然后进行溶解，否则易析出沉淀），轻轻摇动，使制品全部溶解（注意勿使产生泡沫），然后用带有滤网的输血器进行静脉滴注，滴注速度一般以每分钟60滴左右为宜，制品溶解后应立即使用。并在1小时内输完，不得放置。

　　使用剂量由医师视病人的症状而定，本品有50、100、200、300及400IU等不同规格，以供不同情况下使用。每kg体重输入1IU因子Ⅷ，可使循环血液中因子Ⅷ水平提高2.5%左右，一般在轻度出血时需将病人血液中因子Ⅷ含量提高到正常人水平的15%左右，并维持24～72小时。中度出血或小手术时需提高到20%～30%水平，维持48～96小时。大出血或进行较大手术时，则需提高到30%～50%或更高水平，维持4～14天以上。后期的维持量可适当减少，治疗至伤口愈合。根据因子Ⅷ的生物半衰期，在临床使用时一般间隔8～12小时补充输注一次，以保证循环血液中的因子Ⅷ达止血水平。

　　注意事项

　　1.在大量反复输入本品时，应注意出现过敏反应，溶血反应及肺水肿的可能性，对有心脏病的患者尤应注意。

　　2.本品溶解后一般为澄清略带乳光的溶液，允许微量细小蛋白颗粒存在，为此用于输注的输血器必须带有滤网装置，但如发现有大块不溶物时，则不可使用。

　　3.本品对于因缺乏因子Ⅸ（血浆凝血活酶成分，即PTC）所致的乙型血友病，或因缺乏因子Ⅸ（血浆凝血活酶前质，即PTA）所致的丙型血友病没有疗效，故在用前应确诊患者系属因子Ⅷ缺乏，方能对症下药。

　　4.本品不得用于静脉外的注射途径。

　　保存

　　应严格保存于10℃以下避光干燥处。