诱导型一氧化氮合酶与疾病

Inducible nitric oxide synthase in diseases

CHEN Shen-ren, CHEN lin-xin

　　(The 2nd Clinical School in Medical College of Shantou University,Shantou 515041)

　　CHEN Shao-ru(Pathophysiology of Medical College, Shantou University, Shantou 515031, China)

　　【A Review】　Nitric oxide(NO) is a biologically active molecule in vivo，it has been found to play an important role not only as a cytotoxic effector but also an immune regulatory mediator and a signal molecule of message transmission．The inducible NO synthase (iNOS) produces NO after cells were activated and play a rather complicated pathophysiological action in a variety of human diseases or disorders. The molecular biological character of iNOS，its expression in human diseases and probable significance were reviewed.

　　［MeSH］ Nitric Oxide; Disease

　　迟至20世纪80年代末，一氧化氮(nitric oxide， NO)才被认识到是人体内一种生物学活性分子。人体内的NO有两个来源。一为非酶生(non-enzymstigenese)，来自体表或者摄入的无机氮的化学降解/转化；一为酶生(enzymstigenese)，由NO合酶(NO synthase NOS)所合成。现已认识到NO既是一个有细胞毒性效应器作用的分子，是组织损伤的诱发因子和各种病变的增强因子，有其病理上不好的一面；又是生物体许多部分的信号(signal)分子，是先天性免疫应答的调节性效应分子，作为一种信息传递物质维持正常的生理功能，有其生理性好的一面。NO的这种双重性在人体的生理和病理过程中起了非常重要的作用［1］。

　　人体内的NOS目前发现并定名有3类。基因定位于第12对常染色体的I型NOS主要存在脑和神经细胞的细胞质内，称为脑型(bNOS)或神经型(nNOS)［2］；定位于常染色体7上的III型NOS主要存在于血管内皮细胞的细胞膜上，称为内皮型(eNOS)［3］；I型和III型又统称构成型(constitutive NOS，cNOS)，是许多正常组织中基本存在的一种酶，其合成的NO在维持神经细胞的效应传递功能和血管的舒缩功能，保证血管扩张、血液供应上很重要。

　　cNOS合成的NO寿命极短(几秒到几分钟)。定位于第17对常染色体上的II型NOS称为诱导型(iducible NOS，iNOS)，只在细胞受到刺激被激活后才表达［4］。生产NO能持续相对较长时间(几h到几d)。短暂合成和持续产生的这两种NO在病理生理学上的意义完全不同［5］。iNOS以存在于白细胞等炎症细胞的细胞质中为代表(也发现于脑、胰、视网膜、肝、肺、心脏或肾脏等许多器官组织)，与炎症、肿瘤、退行性变等许多疾病有关。诱导iNOS的刺激物包括血红素、细胞因子、需氧应激、IFN-γ、 TNF-α、 IL-1α等。本文综述限于 iNOS和各类疾病关系上的认识和理解。

　　一、人iNOS的生物学特征

　　iNOS基因位于第17对常染色体的17cen-ql1.2位上，长约37kb［4］。其转录受细胞因子、脂多糖(LPS)和其他炎症介质控制［5］。但由于这一转录调节相当复杂且有组织特异性，要定性其基因表达的转录和转录后所有转录因子和调节因子尚有一定困难。iNOS的开放阅读片(open reading frame)由27个外显子所编码，包括翻译始动位(于外显子2)和终止位(于外显子27)［6］。人iNOS基因的所有内含子/外显子的界限严格遵守已知的 GT／AG，供体／受体规则。尽管其编码区(尤其辅因子结合位点)的结构与 nNOS和 eNOS非常相似，但iNOS基因在外显子22～26上有多个带，不如 cNOS只在染色体上有1个带。现己通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization , FISH)分析发现iNOS有3个小的等位基因变异，其中1个在抵抗疾病感染上有病理生理学意义［7］。

　　不同组织克隆得到的iNOS cDNA只在其编译的氨基酸序列上有小的差异，而不同种属和不同细胞类型iNOS的异构体具高度同源性(支持为同一基因产物)。和鼠的 iNOS比较，人 iNOS启动子由于在LPS /IFN-γ应答增强子区段核苷酸的变化(-1083～-1229)，对 LPS/IFN-γ反应性低［8］。由 IL-1β、TNF-α和INF-γ所调理诱导的转录因子 NF-κB和 iNOS启动子的结合比较松散［9］。不过，有3个与调节成分(位于启动子区段中-3.8～-16kb之间)同侧的细胞因子反应区足以被细胞因子所诱导［10］。有趣的是，人iNOS基因含有1个与 eNOS相同的需氧应激成分(GAGACC)，在缺氧情况下，这个应激成分诱导NO产生似是防止心血管疾患的关键(通过NO对白细胞粘附、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的抑制)［11］。已发现鼠的iNOS启动子-226～-212处有1个含有与人的缺氧应答成分(hypoxia-reponsive element，HRE)［12］同源序列足以在 IFN-γ活化的巨噬细胞内氧分压下降时通过与缺氧所诱生的缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-l)结合，诱导iNOS合成NO。尽管人HRE的活性因其同义序列上有两处失谐尚存争议，但培养中的人肝肿瘤细胞在缺氧状态下的确诱导了iNOS合成NO［13］。总之，人的iNOS启动子是迄今己知的最大、最复杂的1个，严格控制iNOS基因的表达。

　　人iNOS的 TATA盒位于转录始动部位上游30bp处，巨噬细胞和上皮细胞内的iNOS转录有6％左右在多个起始部位发动，部分甚至从 TATA指导的主起始部位伸延开几百个硷基对的上游区［14］。这样，通过替代拼接(alternative splicing)获得的 iNOS mRNA更多样化且稳定性不同。人iNOS mRNA上有一个含8个部分重叠的开放阅读片的长且复杂的5’非翻译区(5’UTR)，显示了其在翻译水平上的不稳定性和组织特异性［15］；而iNOS基因的3’端多聚(腺苷酸)(poly＜A＞)区域下游10bp处有1个富含 GT的多聚（腺苷酸)信号区(poly＜A＞signal)不同于通常的 poly＜A＞(AATAAA)［16］，也可能造成基因表达及 mRNA稳定性的差异。

　　二、各种疾病中iNOS的表达和意义

　　(一)感染性疾病　NO在人和外环境的界面上起了关键的保护作用。舌表面任何厌氧菌可将唾液中的硝酸盐降解为亚硝酸盐，吞咽到胃的酸性环境形成NO；人皮肤表面也不断释放NO，这是皮肤共生菌将汗液中硝酸盐降解为亚硝酸盐在酸性环境下所形成。长期用抗生素的病人会减少这类 NO的产生。另外，健康人鼻旁窦中NO浓度接近大气污染允许的最上限。这均显示NO在人类抵抗病原体侵入中起了重要作用［1］。

　　在人体内，被活化的巨噬细胞通过NO杀灭鸟胞内分支杆菌、克鲁斯锥虫、大型(热带)利什曼原虫［1］；NO还激活星形胶质细胞抑制新型隐球菌生长［17］；人体血液中的中性粒细胞被细胞因子激活后通过 iNOS合成NO使进入体内的金黄色葡萄球菌和埃舍利希大肠杆菌的酪氨酸硝基化［18］。这均证实 iNOS在各种感染性疾病中的表达。

　　感染并发休克和器官衰竭者死亡率很高。NO是一种内源性血管扩张剂，至今的大多数动物及人体研究提示iNOS合成的NO在脓毒性休克中起了诱发和致病作用，NO产生过多引起脓毒性休克的低血压和血流异常并进一步参与器官功能障碍的发生、发展和扩大。高浓度的NO在体外破坏细胞代谢，损伤DNA引起细胞死亡，直接损伤组织，而且促进吞噬细胞分泌TNF，继而增加细胞因子介导的组织损害，因此，NO也可能参与脓毒血症引起的心肌抑制。因此似乎可得出这样的结论：（1）脓毒性休克所致低血压与NO过量产生有关；（2）NO过量产生使死亡率上升；（3）NOS抑制剂是安全有益的［19］。在脓毒性休克病人应用低剂量特异性NOS抑制剂可部分逆转血管张力下降和血压掉落，但也使心排出量下降［20］。由于NO有扩张血管、阻断血小板和白细胞粘附内皮细胞、清除超氧化物的功能，脓毒性休克时增加NO量可维持小血管内血流，保护内皮细胞不受氧化应激的损害。而iNOS产生的NO可抵消脓毒血症引起的血管收缩作用，并通过细胞毒性作用对细胞内病原体发挥毒杀作用。另一方面，NO有调节细胞因子产生的免疫调节作用，可能对宿主的防御功能有益。因此，过分用NOS抑制剂抑制NO的释放可能有害［19］。

　　在正常人对抗入侵微生物中，在不同感染性疾病中，cNOS和iNOS所合成NO意义的不同；不同器官组织iNOS表达的差异及NO在休克早期和晚期作用的可能差别尚须进一步去阐明。

　　(二)自身免疫性与慢性炎症性疾病　NO氧化产物亚硝酸盐在类风湿关节炎病人滑液中比骨关节炎高6～35倍，多发性硬化病人脱髓鞘部位巨噬细胞的iNOS和硝基酪氨酸染色阳性，这些细胞在培养中也产生大量NO［1］。胰岛素依赖型糖尿病（insulin-dependent diabetes mellilus ,IDDM）型糖尿病90％以上胰岛被破坏，在 IDDM大鼠动物模型浸润于胰岛的巨噬细胞中检出iNOS［l］，且 大鼠胰岛细胞尤容易发生NO诱导的细胞死亡［21］。作为IDDM动物模型的佐剂，同样对人有致IDDM作用的链脲霉素(streptozocin)对胰岛的特异毒性作用至少部分由细胞内释放的NO所致［1］。这些均说明iNOS在自身免疫性疾病中的表达及其合成的NO对组织的破坏。然而，还必须明确是否对其抑制可减轻对此类疾病的组织破坏。系统性红斑狼疱(systemic lupus erythematosus, SLE)病人血清NO水平明显高于正常对照者，而活动期SLE病人血清NO水平又明显高于非活动期SLE，SLE病人血清NO水平与病情活动度呈正相关，和SLE病人dsDNA抗体水平也呈正相关［22］。

　　研究表明SLE病人NO的产生增加主要是通过iNOS的升调节（up-regulation）在被激活的血管内皮细胞和表皮角化细胞中的表达增高［22］。

　　iNOS的免疫反应性表达在气道、血管、肠、肾、心脏、皮肤和牙周根尖等各种慢性炎症性疾病中有些局限于巨噬细胞，但大部分在炎症区周围的上皮细胞。这些细胞iNOS的作用未明，新近资料表明，受累组织局部由iNOS合成的NO不只简单地引起组织破坏，也影响Th1/Th2的平衡。尤其非细胞毒浓度的NO对Th1型细胞因子如IL_2和INF_γ起降调节（down-regulation）作用，并且/或者增加Th2相关分子IL_4和PGE2的产量及IL_4p40基因的表达［23］。因此iNOS合成的NO也局限Th1免疫应答及其所致的组织破坏。另外，由于Thl型细胞因子和iNOS表达的密切相关，iNOS的表达似可作为Thl反应的一个标记，通过检测这个标记物代替众多细胞因子的检测，显示了iNOS作为这些疾病辅助诊断的价值。

　　（三）其他疾病

　　1．慢性神经变性疾病　早老性痴呆和帕金森病人尸检发现脑内iNOS的表达［24］。尽管神经元对NO的细胞毒作用易感性最高，但iNOS表达是疾病晚期表现还是导致病情发展的原因尚未明。

　　2．梗阻性病变　在兔心梗模型，给予特异的NOS抑制剂可明显改善心室功能并增加存活心肌的血流量［1］。人心梗后心肌细胞及浸润的巨噬细胞内检出iNOS酶蛋白，心脏移植后iNOS在心肌和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)中的表达似与收缩功能不全相关［1］。

　　动物卒中模型显示在梗塞区和脑损伤区有NOS表达。基因变异的 nNOS和iNOS不全大鼠中，梗塞总量和神经元损失明显少于正常鼠；相反，eMOS不全的大鼠梗塞总量大于正常［25］。因此，低产量的 NO(由eNOS合成)似有利于增加梗塞中的脑血流量；而神经元产生的 NO(由nNOS合成)和炎症细胞iNOS合成的持续时间较长，产量高的NO可能有神经元毒性作用［1］。以上资料表明，不同类型NOS所合成的NO在梗塞性病变的病理生理机制中起了不同的作用。

　　3．肿瘤　在人的脑、肺、结肠［1］和前列腺［26］肿瘤的血管系统，浸润的巨噬细胞和肿瘤细胞均可能检测到iNOS。NO在肿瘤发展中的作用也很复杂。实验提示肿瘤中少量 NO的产生可增加肿瘤血流量并促进血管新生［1］；而肿瘤细胞自身产生的 NO可抑制细胞增殖(生长受阻)并／或诱导T淋巴细胞凋亡(细胞毒性)［1］。这可解释经常观察到的现象：即伴随肿瘤的生长，宿主免疫功能受到抑制。

　　肝细胞可对几种炎症刺激作出应答而产生NO，新近研究［27］表明慢性肝炎继发肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)病人血清中NO产物水平明显高于非HCC者，也明显高于肝硬化（LC）并发HCC者。相关分析证实血清NO产物含量与HCC肿块表面面积和肿块体积呈正相关。认为NO在HCC病人肝癌的巨噬细胞或枯否细胞诱导的肿瘤细胞毒性中起主要作用。

　　iNOS的免疫组化染色显示前列腺癌组织iNOS含量明显上升，而良性的前列腺增生iNOS并不上升，提高前列腺上皮iNOS表达可作为前列腺癌特异性免疫组化标记，有助与增生的鉴别诊断。由iNOS产生的NO在前列腺癌的发生发展中可能起了多方面的作用［26］。

　　4．移植／植入　心脏同种移植的受体，iNOS的表达最多见于移植后第1个180天内的心肌细胞和 VSMC，似乎和心脏收缩功能不全有因果关系［1］。在松驰了的关节假体周围发现与排异炎症反应有关的各种细胞内有iNOS表达［28］。被激活并吞噬有假体磨损碎片的巨噬细胞内也有iNOS活动，这可能是造成早期假体修复失败的原因。

　　5．损伤　用紫外线(ultraviolet,UV)-A或 UV-B照射后的正常人志愿者皮肤切片发现iNOS mRNA和iNOS酶蛋白分布于高度增殖的角化细胞的基层。iNOS表达高峰在照射后24h，而72h后未发现。这和日晒斑高峰于24h且持续2天的动力学特征相符。似乎表明了较长的日晒所引起的局部血流量增加和红斑水肿形成是iNOS活动所致。不管是内源性还是外源性的NO可保护人的皮肤内皮细胞不被紫外光 UV-A诱导发生DNA断裂和细胞凋亡［29］。动物实验还证实 NO在损伤后愈合中起了积极的作用［30］。

　　在创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)的动物模型发现损伤后24～48h于损伤周围血管和浸润的中性粒细胞内有iNOS表达，人的TBI应该也是相似的。

　　三、小结

　　在啮齿动物的研究中，提示了 iNOS活动在实验性自身免疫性或慢性炎症过程及其他一些疾病中可能起了有害作用。然而，鉴于实验性疾病病程短以及实验动物种属相对低等，其免疫反应系统相对较简单，调节也不像人类那样复杂严密，为此，在人类疾病和iNOS表达的关系上，NO对这些疾病发生发展的意义尚须进一步深入研究。另外，iNOS表达最常见于上皮细胞，其因未明。在这方面，NO似作为一保护剂使细菌等侵入局限，并对炎症反应起调节作用。还有，NO也影响基因调节，如通过抑制 NF-κB活性或抑制 DNA与 NF-κB、 AP-l和锌指(zine finger)转录因子 SPl来抑制 Thl类免疫反应。在人类这种较高等动物中，iNOS的作用或许不是直接的细胞毒作用，而是基因调节作用［1］。

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