人造血干细胞扩增的研究进展

    progress on Study of Techniques for Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells

　　chem Yongle1,Ling Weijun2,Peng Dongxian 1(1.Zhujiang Hospital ,The First Military Military medical Uniuersity.Guangzhou 5102082 2.The 421 st Hosspital of PLA)

　　造血干细胞（llematopoietic stem cells,HSC）移植可能使遗传血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤等完全治愈，由于HSC移植存在以下不足而受限制：⑴为获得足够量移植用HSC，必须进行大规模的骨髓抽吸或餐周血分离；⑵获得的HSC量有限；⑶HSC输注后产生的成熟细胞的生物动力欠佳，移植后1-3周内并无直接治疗疗效。移植前HSC培养扩增，可解决这些难题。当前主要有两种：⑴细胞因子支持下筛选CD34+细胞的体外扩增；⑵基质支持下的灌注培养。下面就HSC培养的发展、HSC扩增方法以及展望等作一综述。

　　1 早期HSC培养及启示

　　1半固体培养体系 1966年，Bradley等[1]介绍了一种新的半固体培养方法（即集落形成法）用以培养骨髓。此法利用胶体凝胶作支托，没有细胞微环境，只能维持造血祖细胞在1-2周内形成细胞集落，不能支持HSC的生长或分化。即使没法加入营养物、生长因子等，培养时间也只能延长到2-4周。由半固体培养体系的期限性可推断，早期原始HSC不能在这样的培养体系中存活、增殖。

　　2Dexter培养体系 Dexter等[2]于1977年建立了骨髓液体培养体系。此培养法基础是建立一骨髓基质细胞支持层（包括成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和网状细胞等），形成二维空间结构，培养体系不单提供了营养、细胞因子，而且提供了类似于体内的细胞-细胞关系，使此法纤维造血8-12周[3]。极限稀释法技术证明，在Dexter培养体系中，前造血祖细胞在培养第一周前已开始减少[4]。应用细胞免疫表型分析提示，该体系培养的骨髓CD34+、CD38-细胞不能更新复制[5]。早期造血细胞体外培养扩增方法的研究启示：HSC细胞可在体外培养，但两种培养方法均没有建立适合其体外造血的微环境。寻求建立，一个合适的人HSC培养体系是研究的关键。

　　2 目前HSC的体外扩增方法

　　理想的SHC培养方法要求既能最大限度地扩增各阶段的造血细胞，又能维持甚至扩增HSC。目前较为成功的人HSC体外扩增方法主要有两种：⑴细胞因子支持十筛选CD34+细胞的体外扩增；⑵基质支持下的灌注培养。

　　2.1 细胞因子支持下筛选CD34+细胞培养

　　2.1.1 HSC的特性 HSC没有任何形态方面的特征，也没有独特的免疫表型迄今尚无直接检测的方法。HSC只能通过脾结节形成法检测，也可通过检测高增殖潜能集落形成单位（CFU-HPP）长期培养启动细胞（LTC-IC）反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/弱+、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其Rh-123荧光呈阴性或低强度，对4-HC/5-Fu有抗性。HSC是不均一的细胞群体，早期的造血细胞大部分处于G0/G1期，启动慢，但扩增持续时间长，扩增倍数高，造血细胞产量高。较成熟造血细胞启动快，短期扩增倍数高，维持时间短，产物多是成熟细胞，造血祖细胞产量少。

　　2.1.2 细胞因子的造血调节根据细胞因子对造血细胞不同的作用阶段将其分为：⑴特异性细胞因子：大多作用于分化后期，包括EPo、TPo、M-CSF、G-CSF和IL-5；⑵无系特异性细胞因子：作用于分化状态的HSC，包括IL-3、GM-CSF和IL-4，其功能主要维持处于G0期之外所有HSC的生存、增生；⑶G0期作用细胞因子：包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF和SCF，维持早期HSC的存活或促其分化扩增：⑷抑制血细胞生成的细胞因子：包括TNF-α、TNF-βIFN和MIP-1α等，其中INF和TNF-Αfq系特异性，TGF-β主要抑制早期血细胞生成，MIP-α抑制原始的HSC的增殖[6]。

　　2.1.3 扩增策略 目前细胞因子支持下筛选CD34+细胞体外扩增方法研究最为普遍。实验证明，筛选早期HSC剔除成熟的CD34-细胞进行扩增，可获得更好的效果[7]。单独应用一个细胞因子扩增人HSC效果不佳，多个因子合理组合才能获得理想的扩增效果。一般认为，生长因子合理组合应包括：⑴抑制细胞残死亡的存活因子，如IL-1、IL-6和SCF等⑵刺激早期造血细胞增殖的因子，如SCF、IL-3和GM-CSF等；⑶定向扩增刺激因子，如G-CSF和EPO等[9]。

　　Moore[10]用delta培养法培养骨髓CD34+细胞，发现未用因子时CFU-GM迅速消失；而单用SCF、IL-1、IL-3或IL-6等因子时，14天培养CFU-GM维持不变或只扩增2-8倍；用SCF/IL-3联用另3个或3个以上因子组合扩增效果更好。多数人认为合适的细胞因子组合为IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17扩增经动员外周血（MPB）CD34+细胞，使CFU-GM增殖66倍[11]，以扩增非MPBCD34+细胞，使CFU-GM增殖55倍[12]。而Bruggert等[13]则认为SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD最适于外周血CD34+细胞扩增，12-14天培养，扩增CFU-GM250倍，CFU-Mix25倍。而扩增脐血CD34+、CD45RA low、CD77low的CFU-GM（70倍）和BFU-E（55倍）的最好因子组合分别为SCF/IL-6/PIXY/M-CSF和SCF/IL-6/IL-3/EPO，扩增两者的最佳组合是SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期HSC大部分无IL-6R表达，IL-6/Sil-6R复合体激发HSC表达gp130，启动HSC自我复制的信号传递，而c-Kit/SCF是HSC自我自制扩增的另一信号传递途径。无血清条件下，IL-6/SIL-6/SCF孵育人脐血CD34+细胞，细胞总数和造血祖细胞数随Sil-6R增加而明显增加，培养14天，

　　CFU-GM扩增近70倍，集落中除了几个CFU-M和BFU-E外，有大量（≥60%）的CFU-GEMM和CFU-Blast；有血清的情况下，培养7天，14天，分别扩增CFU-Mix60倍和70倍。由此说明，细胞因子促进造血是通过与期受体结合引起信号传递而起作用的，为体外造血研究开创了新的思路。

　　细胞因子支持下筛选CD34+细胞扩增法有以下优越性：⑴条件容易控制，产量稳定；⑵无异体基因污染。缺点是：目前还无可完全代替基质的细胞因子，单用因子不能维持体外长期造血；需不断加入因子，费用昂贵，不能大规模使用。

　　2.2 基质细胞支持的灌注培养

　　此培养方法提供HSC一个接近于体内的造血环境，能扩增各阶段的造血细胞，并维持甚至扩增原始HSC，称原始HSC培养方法。

　　2.2.1 基质支持作用 此作用除了通过细胞-细胞接触的直接作用外，还分泌许多因子影响造血过程。骨髓基质是最常用的造血支持层来源，包括基质细胞、基质细胞分泌的胞外基质（胶原、纤维结合蛋白、层素、糖蛋白等）以及多种造血生长因子（如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-6、INF-α、IFN和TGF-β）调节HSC的造血动力学。用作造血支持的基质细胞除骨髓外还包括其它许多来源的细胞。基质细胞与HSC可以同基因或异基因、同种或异种。此外，还建立了许多转化的基质细胞系，用于造血支持。经过转化的基质细胞系具有分泌细胞因子的功能，加强造血调控。Otsukat等[16]报道，在长期培养体系中，以基因工程改造的成纤维细胞为支持细胞，使之分泌GM-CSF、G-CSF和IL-3因子，相同浓度下，这些因子对HSC增殖有更强的刺激作用。

　　直接比较基质支持培养和细胞因子支持培养的扩增效果显示，目前可能用到的任何细胞因子都无法完全代替基质细胞的支持作用。因子培养结果，原始HSC常常减少，而只有基质支持的培养可使原始HSC维持不减甚至扩增[17，18]。有实验显示，骨髓的LTC-IC在细胞因子支持下培养只维持35%的启始量，而基质细胞却能令其扩增5倍[16]。脐血LTC-IC在因子作用下培养7天，扩增2-7倍，培养14天，扩增2-3倍，而基质细胞却可达加倍的扩增效果[19]。用微孔网把HSC和基质隔开称基质非接触共培养，近期文献认为，HSC与基质接触与否并不影响增殖分化[20]。相反，非接触可部分地使HSC与产生增殖负性细胞因子信号的隔开，减轻造血受抑。

　　2.2.2 造血生长因子支持作用。基质支持灌注培养常加用因子，以加强HSC的扩增效果。因子一方面支持基质细胞，起间接造血作用，一方面直接刺激HSC存活、增殖、分化。Koller等[18]在生物反应系统中，加入IL-3/IL-6/SCF培养脐血单个核细胞（MNC），15天培养扩增CFU-GM11倍、5天BFU-E2.5倍、3天CFU-Mix5.3倍及5天LTC-IC3个样品中2个扩增3倍。他的另一实验，基质细胞支持培养不同纯度的人骨髓CD34+细胞，采用多种因子组合比较，以IL-3/IL-6/SCF/EPO及IL-3/GM-CSF/SCF/EPO扩增效果最佳，细胞、祖细胞数明显增加，而且维持LTC-IC不减[17]。

　　2.2.3 介质灌注作用 介质灌注是影响HSC培养的又一重要因素。介质灌注可以保证营养、细胞因子等供应，清除有造血抑制代谢产生，刺激基质细胞分泌因子[21]。控制适当的介质灌注，显著地提高体外造血的效率。已知，体内组织细胞细胞密度为5×108·ml-1的浆灌注为0.1ml·kg-1·min-1，相当于细胞密度为106·ml-1，含20%血清的培养介质，每天全部更换一次。Schwartz等[22]按7V·W-1，3.5V·W-1和1V·W-1换液培养低密度的骨髓MNC，发现3.5V·W-1换液效果最好，可维持造血20周。整个过程，细胞产量传统Dexter培养法的3倍，而且维持祖细胞稳定生产直到18周，在已报道文献中，造血维持时间最长。Plasson等也发现同样结果。

　　2.2.4 氧浓度的影响 Koller等认为5%低氧化正常20%氧浓度更能刺激造血，实验见CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM分别扩增12倍、3倍和4倍。此外，延长祖细胞维持时间1-2周。而Palson等的实验则显示20% o2最利于体外造血，40% O2次之，5%及60%O2最差。

　　2.2.5 生物反应器作用 有人通过改进反应器提高HSC扩增效果。如Davis等[26]利用人造血毛细血管系统用猪内皮细胞支持培养骨髓CD34+细胞、培养18天，CD34+细胞扩增150倍、CFU-GM1600倍、CFU-Blast77倍，效果特点显著。应用该体系，造血祖细胞及早期造血细胞均获相当高的扩增，似乎找到HSC扩增的真谛。

　　2.2.6 培养启始HSC纯度影响 低纯化或不纯化MNC灌注培养具有以下优点：⑴保存尽量多的CD34+辅助细胞；⑵大量的基质细胞在培养过程中可形成支持层；⑶减少筛选过程对HSC破坏。Koller等用不同纯度的CD34+LIN-细胞灌注培养，证明CD34+LIN-细胞纯度越低，扩增细胞、CFU-GM和LTC-IC倍数越高，而以后两种最受影响。

　　2.2.7 其它 细胞接种密度和收获时机对HSC扩增效果有一定影响。粘附因子介导HSC和基质细胞的接触刺激HSC增殖分化，也是不可忽视的因素。

　　基质细胞支持下灌注培养有如下优点：⑴维持造血时间长达数月（≥5月）；⑵可维持LTC-IC不减甚至扩增；⑶细胞因子应用少，费用低；⑷扩增前无太多的处理，保持HSC的活性，避免去除辅助细胞。缺点是条件不易控制，产物不稳定。

　　3 展望

　　由于目前对HSC的特性尚未透彻了解，所以HSC体外扩增要获得不同阶段的细胞大量增殖，同时扩增原始细胞量遇到困难。以后研究可以主要集中于以下几个方面。

　　3.1 HSC增殖分化的调控基因研究 在分子水平和基因水平把握造血的的机制，指导体外HSC的培养，HSC逐渐分化，丧失自我更新的能力，可有由于基因易位和重排所致。若然如此，通过基因重新复位，可使一个已经分化的细胞返祖为HSC。在此领域研究信号传导机制，可以在关键点阻断HSC分化信号传导，而加强自我更新信号传导，提高HSC的扩增。

　　3.2 新的造血生长因子的发现，目前所用的造血生长因子均无法代替基质细胞的作用，说明仍存在某种未知的关键造血调控因子。致力于新的造血生长因子发现，将对改善HSC培养起巨大作用。

　　3.3 定向细胞培养 使HSC向某一系定向增殖是HSC培养的新方向。针对临床不同需要，选择性扩增红细胞、粒细胞、淋巴细胞、血小板、NK细胞等具有广阔的应用前景。

　　可以相信，随着细胞生物学，分子生物学及其相关学科和技术的发展，对HSC了解会更加明了，HSC的扩增会逐步完善。HSC扩增技术的发展将为血液系统疾病、肿瘤的基础研究和临床治疗提供充足的材料和新的技术方法。

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