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摘要 目的：观察庆大霉素慢性耳中毒前后蒙古沙鼠内侧橄榄耳蜗（medial olivocochlear,MOC）传出神经的形态改变及其与毛细胞损害的关系，以探讨MOC传出神经在氨基糖甙类抗生素慢性耳中毒中的重要性。方法：采用改良的乙酰胆碱酯酶组化染色和甲苯胺蓝-苏木素染色法，全耳蜗铺片观察健康对照组和庆大霉素组耳蜗MOC传出神经和外毛细胞（outer hair cell，OHC）的分布特征，并测量耳蜗MOC传出神经纤维、末梢及OHC的数量。结果：停药后3周出现耳蜗MOC纤维和末梢损害，损害程度随观察时间延长而加重，11周最明显, 且损害部位主要在耳蜗底回，与毛细胞损害的特征一致。结论：耳蜗MOC传出神经可能在庆大霉素慢性耳中毒时OHC的损害中起重要作用。 氨基糖甙类抗生素耳中毒的确切机制尚不明。近年来形态学和电生理研究证明，听觉感受与传入活动受内侧橄榄耳蜗（medial olivocochlear, MOC）传出神经系统的支配和调控［1,2］，同时还发现氨基糖甙类抗生素急、慢性耳中毒时MOC功能明显损害［1-3］，提示氨基糖甙类抗生素耳中毒可能与听觉传出神经系统损害有关。本研究采用乙酰胆碱酯酶组化染色法，观察庆大霉素慢性耳中毒后MOC传出神经纤维和末梢的形态改变，报道如下。 材料及方法 一、动物分组 蒙古沙鼠36只，雌雄不限，体重50～60 g，外耳道及鼓膜正常。庆大霉素组24只，每天肌注庆大霉素150 mg/kg，连续10 d，分别于停药后3、7和11周处死，每个观察时间8只；健康对照组12只，与庆大霉素组同批处死，每个观察组4只。每只动物1耳行MOC传出神经染色，另1耳行毛细胞染色。 二、MOC传出神经染色 按以往采用的乙酰胆碱酯酶染色方法［4］，动物注射1％戊巴比妥钠麻醉后，断头处死，迅速取出听泡，用0.1 mol/L磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，pH7.4）洗去血液后，置于4℃固定液（4％多聚甲醛,0.5％戊二醛,0.2％苦味酸）中，立即去除镫骨，开放卵圆窗和圆窗，蜗尖钻孔，将固定液分别从蜗尖和两窗灌注，置4℃冰箱中继续固定过夜，经0.1 mol/L EDTA-Na2 （ethylene diamine tetraac-etic acid，乙二胺四乙酸）脱钙3 d，每天换液1次。然后去除蜗壳、螺旋韧带、盖膜，并分割成底回、第二回和蜗顶3段，室温下行组化染色。首先经0.1％H2O2 处理30 min，0.1 mol/L PBS 漂洗，后用1％Triton X-100处理1 h, 0.1 mol/L马来酸缓冲液(pH 6.0)漂洗，再置组化反应液（含35μmol/L碘代乙酰硫化胆碱、5μmol/L K3Fe(CN)6 、30μmol/L CuSO4、50μmol/L枸橼酸钠）中作用50 min，经50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）漂洗后置标记染色液（0.04％二氨基联苯胺和0.3％硫酸镍铵）中作用5 min，再置含0.003％H2O2的同一溶液中继续染色10～15 min, 最后在5 mmol/L Tris-HCl中漂洗，中止反应。标本染色后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 三、毛细胞染色 按Ulehlova等［5］的甲苯胺蓝-苏木素染色方法改良，过程如下：动物麻醉后断头处死，迅速取出听泡，用10％甲醛溶液从圆窗、卵圆窗灌注，后固定24 h，经0.1 mol/L EDTA-Na2脱钙，按上述方法制备标本后染色。先经0.1 mol/L PBS漂洗后, 在含1％乙醇的甲苯胺蓝饱和溶液中染色20 s, 0.1 mol/L PBS漂洗, 再经苏木素溶液中复染1min，0.1 mol/L PBS漂洗, 甘油封片。 四、结果分析 在网格测距器下计数并对比分析健康对照组和庆大霉素组第3、7和11周耳蜗底回、第二回和蜗顶MOC传出神经纤维、末梢及外毛细胞(outer hair cell，OHC)的数量，计算平均值，各组间差异行t检验。 结果 一、MOC纤维和末梢在耳蜗的分布 健康对照组MOC纤维及其末梢的密度和大小在耳蜗各回的分布不一致。在底回起始端纤维短，底回中部纤维细长，神经末梢小，其分布较稀疏（图1），底回远端和第二回神经纤维和末梢密而粗大,至蜗顶部相对稀疏而细小。庆大霉素停药后3周底回起始端和中部MOC纤维及末梢部分消失，第二回无明显变化；7周底回起始端和中部MOC纤维和末梢大部分消失(图2)，跨隧道纤维减少，第二回纤维和末梢部分消失；11周底回起始端和中部MOC纤维和末梢基本完全消失，仅在远端残留少量MOC纤维, 第二回和蜗顶的纤维和末梢也明显减少，跨隧道纤维稀少。定量分析显示耳蜗MOC纤维和末梢损害依不同部位和观察时间而异，损害程度随观察时间延长而加重,以耳蜗底回和停药后11周损害最显著，差异有显著性(P＜0.001，图3,4)。 图1 健康对照组MOC纤维和末梢在耳蜗底回的分布。×100 图2 停药后7周耳蜗底回MOC纤维和末梢大部分消失。×100 图3 健康对照组和庆大霉素组停药后不同时间MOC纤维在耳蜗的分布（100 μm基底膜MOC纤维平均值）。*P＜0.001，下图同 图4 健康对照组和庆大霉素组停药后不同时间MOC末梢在耳蜗的分布（100 μm基底膜MOC末梢平均值）。 MOC末梢消失 二、OHC的改变 庆大霉素组OHC的损害程度因观察时间和部位而异，停药后3周开始出现OHC散在或灶性缺失，随观察时间延长呈进行性加重，以11周最明显。损害部位从底回开始，逐渐累及第二回及蜗顶, 以底回和第一排OHC损害明显(图5)。 图5 健康对照组和庆大霉素组停药后不同时间OHC 计数（100 μm基底膜OHC平均值）。*P＜0.01 讨论 近年来听觉传出神经系统对耳蜗机械及听觉传入活动的调控作用日益受到重视。研究表明，MOC传出神经在耳蜗的分布因不同动物、耳蜗不同的解剖和功能部位而异。Xie等［4］和Henson等［2］采用乙酰胆碱酯酶染色和耳蜗铺片技术，对回声定位蝙蝠的MOC传出神经进行定量研究，发现蝙蝠的MOC传出神经纤维及末梢在耳蜗最敏感的频率调谐部位较粗大且分布最密集，与该部位进行精确的频率分析和生物声纳信号的处理有密切的关系。本研究结果表明，蒙古沙鼠MOC传出神经纤维和末梢在耳蜗不同部位的分布存在明显差异，在底回远端和第二回分布最密集，纤维和末梢最粗大，其生理意义有待研究。 以往的研究表明，一次性注射庆大霉素能可逆性消除对侧噪声对耳蜗复合动作电位、耳蜗共振和阻尼的抑制作用，认为庆大霉素通过抑制MOC传出神经而改变耳蜗机械特性和听觉传入活动，其机制可能是阻断传出神经递质，进而改变OHC的K+-Ca2+离子通道［1-3,6,7］。但氨基糖甙类抗生素慢性作用对听觉传出神经系统的影响尚不清楚。早年有学者注意到氨基糖甙类抗生素对耳蜗OHC的损害与MOC传出神经在耳蜗的分布有关，提出MOC传出神经可能在氨基糖甙类抗生素耳中毒时毛细胞的损害中起作用。本研究发现耳蜗MOC纤维和末梢损害依不同部位和观察时间而异，以底回损害出现最早、最显著,损害程度随观察时间延长而加重，11周后损害最明显。Capps等［8］研究发现切断交叉橄榄耳蜗束后，卡那霉素对耳蜗OHC的损害作用减轻。该结果与我们关于庆大霉素慢性耳中毒时MOC功能改变的观察相一致，即MOC功能亦出现进行性、不可逆性损害，证明庆大霉素慢性作用对MOC传出神经系统的形态和功能产生明显损害。 听觉传出神经与毛细胞损害之间的关系不明。Dulon等［9］在OHC部位传出神经末梢发现有荧光素标记的庆大霉素。另外，在慢性实验中发现，庆大霉素在OHC中的聚集部位和浓度与传出神经末梢的分布一致［10］。本研究发现，庆大霉素慢性耳中毒时MOC传出神经和OHC形态和功能损害有关，均以底回受损最早而明显，逐渐向蜗尖发展，随观察时间延长而进行性加重，提示听觉传出神经可能在氨基糖甙类抗生素耳中毒时毛细胞损害中起重要作用。 本文为国家自然科学基金资助课题（批准号：39770795） 作者单位：谢鼎华 郭运凯 伍伟景 杨新明 贺湘波 长沙 湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科 410011 参考文献 1 Henson OW Jr, Xie DH, Keating AW, et al. The effect of contralateral stimulation on cochlear resonance and damping in the mustached bat: the role of the medial efferent system.Hear Res,1995,86:111-124. 2 Henson MM, Xie DH, Wynne RH, et al. The course and distribution of medial efferent fibers in the cochlea of the mustached bat.Hear Res,1996,102:99-115. 3 Smith DW, Erre JP, Aran JM. Rapid, reversible elimination of medial olivocochlear efferent function following single injections of gentamicin in the guinea pig.Brain Res,1994,652:243-248. 4 Xie DH, Henson MM, Bishop AL, et al. Efferent terminals in the cochlea of the mustached bat: quantitative data. Hear Res,1993,66:81-90. 5 Ulehlova L, Voldrich L.Modified staining technique for surface prepartion of the organ of Corti.Hear Res,1987,26:221-224. 6 Avan P,Erre JP,da Costa DL,et al.The efferent-mediated suppression of otoacoustic emissions in awake guinea pigs and its reversible blockage by gentamicin. Exp Brain Res,1996109:9-16. 7 Schacht J.Biochemical basis of aminoglycoside ototoxicity.Otolaryngol Clin North Am,1993,26:845-856. 8 Capps MJ, Duval AJ 3d.Ototoxicity and the olivocochlear bundle.Laryngoscope,1977, 87:1110-1118. 9 Dulon D, Zajic G, Avan JM, et al. Aminoglycoside antibiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci Res, 1989, 24:338-346. 10 Hiel H,Erre JP,Aurousseau C,et al.Gentamicin uptake by cochlear hair cells precedes hearing impairment during chronic treatment.Audiology,1993,32:78-87. |
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