HCV包膜蛋白的免疫与疫苗研究进展

　　 摘　要　近年来使用得组蛋白及合成肽的研究表明，在HCV膜区存在多个B细胞表位，抗外膜蛋白抗体的检出率高度依赖于抗原获得的方法、不同的感染阶段以及检测模式，随着噬菌体呈现技术、转细胞技术、核酸免疫技术等用于HCV感染的致病机理及疫苗研究，对进一步完善和发展有较HCV疫苗提供了新的途径。

　　丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子，虽然通过对献血者进行抗-HCV的筛选使输血后HCV的感染率得到了显著的降低，但在高危人群中仍存在社区获得性的HCV感染，目前全世界约有1.7亿HCV感染者,其中约有50%急性感染者转变为慢性,进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌.HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。可能的原因是：（1）HCV高度变异，逃避机体的免疫清除；（2）HCV在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱；（3）病毒颗粒与低密度脂蛋白或免疫球蛋白紧密联接，导致抗原决定簇被掩盖；（4）外周血淋巴细胞可能有HCV储存库的作用[1]，对HCV感染目前还有一种有效的治疗手段，慢性HCV感染者对-α干扰素的反应可低至15%～25%，其它抗病毒核酸类似物的效果甚微，因此，需要提高治疗手段及发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV的包膜蛋白是宿主攻击的主要目标，一直都是HCV疫苗研制的首选抗原。本文概述了近年来对HCV包膜蛋白的体液免疫及疫苗研究等方面的进展。

　　1 HCV包膜糖蛋白的结构特征

　　HCV属于黄病毒家族的一员，其基因组全长约9.4kb，编码3010～3 033个氨基酸的多蛋白前体，结构蛋白（核心蛋白C，包膜蛋白E1和E2）在宿主内质网中信号肽酶的作用下[2，3]，裂解出包膜蛋白E1和E2对应的氨基酸位置分别为E1：192～383；E2：384～809。E1糖蛋白是一个约30～35kD的糖基化蛋白，含N-糖基化位点5～6个，脱糖基后为21kD。E2糖蛋白含糖基化位点约11个，其糖蛋白的分子量为58kD～70kD，在内源性糖基化酶的作用下，得36kD～40kD的脱糖基蛋白[4]。目前的研究表明，HCV e1、E2蛋白通过非共价键相连形成异源二聚体，代表了HCV包膜糖蛋白的天然构象。E2的N端为高变区（HVR），HVR1位于氨基酸的384～411，日本学者的研究显示，在474～480位存在第二个高变区（HVR2），但对它的研究相对较少。

　　2 HCV包膜糖蛋白的体液免疫

　　2.1 HCV外膜区B细胞表位。病毒的包膜蛋白对于宿主产生体液免疫反应很重要，因为宿主首先接触的是包膜蛋白，而且这些蛋白的表达水平较高；宿主的保护性免疫常依赖于针对病毒表面蛋白的抗体，该抗体能阻断病毒与敏感细胞的结合，也可能通过加强细胞免疫清除病毒，因此，研究针对HCV包膜蛋白的体液免疫具有重要意义。HCV感染后血清中病毒含量极低，同时目前缺乏有效的体外培养系统及合适的动物模型繁殖病毒，无法获得大量的天然病毒抗原，目前只能通过合成肽或基因重组的方法，获得HCV包膜蛋白抗原，用于研究HCV感染者中针对HCV包膜蛋白的免疫特征。

　　根据外膜区推测的相应氨基酸序列，合成一系列相互重叠的多肽作为抗原，可对外膜区的抗原表位进行定位。Ray的研究表明，在E1区存在两段潜在的表位，P1：210～223，P2：315～327，P1位于变异较大的区哉，P2位于高度保守的区哉，在38份感染者血清标本中，有35份（92%）与P2反应，仅17份（44 .7%）与P1反应[5]。Jackson等的研究认为，代表E1、E2非高变区肽20段中仅1段与45份抗-HCV（+）血浆标本有明显的反应，而代表高变区的24个肽中有18个与抗-HCV（+）的血浆标本反应，且40%的血标本与两个以上的肽起反应，其中有的肽段的差异达50%以上，有两份血标本与7个不同的肽序列有交叉反应，结果表明，许多抗-HCV（+）的标本中有广泛的抗高变区抗体存在，可能这些抗体限制了高变区序列的变异[6]。多数研究认为在HVR1存在中和性的抗原表位，而在HVR2则没有，目前认为，HVR1的B细胞表位包括：400～409aa[7]、398～410aa[8]以及399～405aa[9]。

　　这种使用合成肽鉴定表位的技术也存在一些问题。首先，合成肽只能反映线性表位，而忽视了外膜糖蛋白中的许多构象型表位。其次，鉴定出的表位能否在体外诱导中和性抗体，在体内产生保护作用还有待进一步研究。

　　2.2 HCV抗外膜蛋白抗体的检出及意义。使用HCV重组外膜蛋白作为抗原检测HCV感染者中抗外膜蛋白的抗体，其检出率在不同研究者中的差异很大。多方面的因素影响抗外膜蛋白的检出。首先，抗外膜蛋白抗体的检出高度依赖于抗原产生的方法。使用来自E.coli的E2的融合蛋白作为抗原，在HCV感染者中的检出率低至20%。而使用糖基化形式外膜蛋白作为抗原，在HCV rNA阳性慢性携带者中抗体的检出率可达97%[10]。在缺乏E2的情况下，针对重组E1的反应较低，Kohara用痘苗病毒表达的E1（gp35）作为抗原，仅在少许NANBH患者（7%～23%）的血清中检测到抗体，尽管在这些患者中抗-核心、抗-NS3的抗体检测可高达90%～95%[11]。目前对HCV外膜蛋白的结构研究表明，E1的正确折叠和抗原性依赖于E2，这可解释重组E1在缺乏E2时的微弱免疫反应，表明E1和E2均是HCV疫苗必不可少的成分。因此，将E1、E2在合适的表达系统中共表达，获得具有与天然构象相似的膜抗原，对于发展有效的疫苗是有帮助的。其次，抗外膜蛋白抗体的检出率与HCV感染的不同阶段密切相关。慢性HCV感染者的检出率较急性者为高，而且，在慢性感染的不同阶段，针对HCV蛋白的抗体都能检测到，说明针对HCV外膜蛋白的反应在肝炎起始后即已开始，并在疾病的慢性阶段进一步发展。最后，使用的实验方法也显著影响抗外膜蛋白抗体的检出，以WB（Western-Blot）模式分析蛋白使构象性表位破坏，抗体检出率较低，而用免疫荧光、免疫沉淀、ELISA等方法对蛋白构象的破坏较小，因而检出率较高。

　　目前检测到的抗包膜蛋白抗体的意义还不是很清楚，抗外膜蛋白抗体的检出伴随病毒血症同时出现说明该抗体对于病毒的清除不是完全必要的，大多数抗包膜蛋白抗体是非中和性抗体。而有研究表明针对E2 hVR1 C末端14～27aa的抗体可使相应的相似株减少或消失，该抗体也可阻止病毒粘附于细胞。在E2的HVR1区中存在中和抗体，HVR1区是显露的且形成B细胞表位[7]，与HIV-1的外膜蛋白gp120的V3环同源，易于介导较强的免疫反应。HCV在宿主的免疫选择作用下，形成HVR1区基因的高度变异，以逃避免疫监视。HCV的高度变异成为HCV疫苗研制的首要难题。除HVR1区外。目前认为在外膜区其它部位也存在中和表位。而且有可能目前检测到的抗体大都为针对线性表位的抗体，不具保护作用，而针对构象型表位的抗体，则可能产生保护性免疫，由于我们常规的筛选方法使用的是变性的HCV外膜蛋白，不能检测到此种抗体，无法确立该抗体与HCV转归的关系。因此，获得天然膜蛋白，对于发展灵敏的诊断实验和疫苗研究均有帮助。

　　3 HCV外膜糖蛋白与疫苗研究

　　HCV外膜蛋白为HCV疫苗研制的首选抗原。以HCV外膜区基因为基础的疫苗首先必须解决其变异问题。Cloo等用Hela细胞表达的重组HCV e1/E2免疫黑猩猩后，用10CID的同型病毒攻击，结果7只中有5只受到了保护，而对照组则发生急、慢性感染，结果表明HCV的外膜抗体具有一定的中和能力。但这种保护是“单特异性”的，仅对同型病毒的再感染有保护作用[12]。这是由HCV的基因变异决定的，HCV不仅存在多种基因型和亚型，在同一个体中，也包含多个相似株（quasispecis），在感染的不同阶段，相似株也发生变异。针对HCV的混合抗体或许对清除感染有用。最近，Puntoriero根据200份不同的HCV分离株的E2 hVR1序列，构建了HVR1噬菌体肽库，从中筛选出能和较多血清发生反应的噬菌肽，用这些肽去免疫动物，产生的抗血清可以和90%以上不同的HVR1合成肽发生交叉反应，用这种多条噬菌体作为抗原可以解决HCV膜区基因高变问题。但是，该研究中使用的抗原仍然是合成肽，并且其在动物实验中的保护作用还有待进一步研究[13]。

　　其次，以HCV外膜区为基础的疫苗的另一个难题是膜区蛋白的来源问题，通过体外表达获得足量具有天然构象或与天然构象类似的蛋白是HCV疫苗新的来源。最近，Baumert等构建了只含HCV结构基因（即HCV/C、E1和E2）的杆状病毒表达质粒，在该质粒转染的相同，颗粒含有部分HCV rNA，说明没有非结构区，没有HCV本身的RNA聚合酶，同样可以完成病毒RNA的复制和病毒包装[14]。这就为体外获得具有天然构象的HCV膜抗原提供了一条途径，为HCV的疫苗研究奠定了基础。Lagging将HCV膜基因，即HCV e1（174～359）和E2（371～742）基因连接在疱疹性口炎病毒（VSV）G蛋白跨膜内区基因相连，这样在E1、E2的C端提供了一个能在膜上锚定的信号，可使镶嵌蛋白在细胞的膜表面得到表达，采用VSV的温敏株（ts045）以及在不能耐受（40.5℃）条件下培养.转基因细胞则可产生VSV/HCV假病毒颗粒,该假病毒颗粒具有再感染哺乳动物细胞的能力,用同型E抗原免疫黑猩猩所获得的免疫血清可抑制VSV/HCV假病毒绵感染性[15],充分表明HCV外膜抗原可用于免疫研究获得中和性抗体,同时,在体外表达系统中可以获得具有结构、功能与天然病毒相似的膜蛋白，该蛋白中含有的构象表位产生的抗体，可能具有保护作用。

　　近年来，核酸疫苗技术的出现，为丙型肝炎的防治提供了一个新的机遇。DNA疫苗是直接将含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA注入体内，经T细胞摄取、转录、翻译、表达出相应抗原，然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答，在HCV防治中，核酸疫苗与传统的重组疫苗及肽疫苗相比，具有多方面的优势：（1）基因免疫具有交叉保护作用，有利于克服HCV外膜基因的高变性给疫苗研制带来了困难。（2）核酸免疫的抗原多肽的提呈过程与自然感染时相似，直接将具有天然构象的蛋白呈递给免疫系统，不会造成构象性表位的改变或丢失；（3）基因免疫同时诱发机体的体液免疫与细胞免疫，效果更好。

　　以含有HCV外膜基因为基础的核酸免疫，现在已进行了多方面的尝试。Lee等构建了不同的含有HCV/E1基因的表达质粒，其中包括含有质粒-单细胞集落刺激因子（GM-CSF）的融合基因质粒。结果表明，含有GM-CSF的融合质粒与只有包膜区基因的质粒相比，诱导的抗体反应和淋巴细胞增殖反应均大大增强，用双顺反子质粒使HCV/E和GM-CSF同时表达，获得最佳免疫效果。同时，产生的强烈的体液免疫反应，除了可产生针对相同基因型病毒膜抗原的HVR1的抗体反应上，还可产生针对异型病毒HVR1的抗体[16]。Nakano等的研究也证实以la型的E2区构建的质粒进行基因免疫产生的抗体也可同lb型E2区抗原发生反应[17]。有研究表明，经DNA免疫的小鼠产生针对HVR1的交叉反应性抗体识别的位点主要位于HVR的C未端，而自然感染过程产生的针对HVR1的交叉反应性抗体识别的表位亦位于HVR1的C末端，充分表明核酸免疫与自然感染过程类似[18]。

　　虽然DNA疫苗还存在安全性问题，即外源DNA是否会与宿主细胞染色体整合而影响某些癌基因或抑制基因的表达。自身免疫及过敏抗体，但由于DNA疫苗与传统的蛋白质疫苗相比，制备简单、成本低廉，这将使DNA疫苗的推广应用成为可能。对HCV核酸疫苗的进一步研究。必将对控制HCV的感染及传播起重要作用。

　　4 结　语

　　总之，近年来使用重组蛋白及合成肽的研究表明，在HCV膜区存在多个B细胞表位，抗外膜蛋白抗体的检出率高度依赖于抗原获得的方法、不同的感染阶段以及检测模式，针对HCV包膜区线性表位的体液免疫对机体的保护作用不大。随着噬菌体呈现技术、转细胞技术、核酸免疫技术等用于HCV感染的致病机理及疫苗研究，期望；（1）能通过使用多价混合疫苗解决HCV的变异难题；（2）在体外获得足量具有天然构象的HCV外膜抗原作为新型的重组疫苗；（3）开发能同时产生具有体液免疫和细胞免疫保护的DNA疫苗；（4）建立HCV感染的细胞模型及动物模型，进一步研究病毒宿主相互的关系，可望对发展有效的HCV疫苗提供帮助。

　　参考文献

　　1 Koshy R,et al. Trends Biotechnol,1996;Oct ;14(10):364-369

　　2 Hijikata M, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1991;Jul 88:5547-5551

　　3 Lin C,et al. J Virol ,1994 ;Aug,68:5063-5073

　　4 Grakoui A, et al. J Virol ,1993;67:1385-1395

　　5 Ray R, et al. J Virol ,1994;July:4420-4426

　　6 Jackson P, et al.Vitology,1997;51;67-79

　　7 Taniguchi S,et al, Virology,1993;195:297-301

　　8 Shimizu YK, et al. Virology,1996:223;409-412

　　9 Scarselli E, et al. J Virol ,1995;69:4407-4412

　　10 Lechner S, et al. Virology,1998;243;313-321

　　11 Kohara M, et al. J Gen Virol ,1992;73:2313-2318

　　12 Choo QL, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1994 ;91:1294-1298

　　13 Puntoriero G,et al. EMBO, J , 1998;Jul 1:17(13):3521-3533

　　14 Baumert TF,et al. J Virol ,1998 May,72(5):3827-3836

　　15 Lagging LM, et al. J Virol,1998;May 72(5):3539-3546

　　16 Lee SW, et al. J Virol,1998;Oct 72(10):8430-8436

　　17 Nakano l,et al, J Virol ,1997;71:7101-7109

　　18 Zibert A, et al. Virology,1995;208;653-661