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抗生素微生物检定法
附录序号
附录Ⅺ
内容全文
A. 抗生素微生物检定法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
培养基及其制备方法
培养基Ｉ
胨 5g 琼脂 15～20g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 磷酸氢二钾 3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ
胨 6g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 琼脂 15～20g 酵母浸出粉 6g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ
胨 5g 磷酸氢二钾 3.68g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸二氢钾 1.32g 酵母浸出粉 3g 葡萄糖 1g 氯化钠 3.5g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ
胨 10g 葡萄糖 10g 氯化钠 10g 琼脂 20～30g 枸橼酸钠 10g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅴ
胨 10g 琼脂 15～20g 麦芽糖 40g 水 1000ml
除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高 0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀， 调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基Ⅵ
胨 8g 磷酸二氢钾 1g 牛肉浸出粉 3g 葡萄糖 2.5g 酵母浸出粉 5g 琼脂 15～20g 氯化钠 45g 水 1000ml 磷酸氢二钾 3.3g
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4,在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅶ
胨 5g 枸橼酸钠 10g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15～20g 磷酸氢二钾 7g 水 1000ml 磷酸二氢钾 3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅷ
酵母浸出粉 1g 琼脂 15～20g 硫酸铵 1g 磷酸盐缓冲液(pH6.0) 1000ml 葡萄糖 5g
混合上述成分，加热溶化后滤过，在115℃灭菌30分钟。
营养琼脂培养基
胨
10g
琼脂
15～20g
氯化钠
5g
肉浸液
1000ml
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为 7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
灭菌缓冲液
磷酸盐缓冲液(pH6.0) 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH7.8) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH10.5) 取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
菌悬液的制备
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液
取枯草芽孢杆菌［CMCC（B） 63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日,用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液 取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液
取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液
取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液
取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液
取啤酒酵母菌（9763）的Ｖ号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。
标准品溶液的制备
标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。
供试品溶液的制备
精密称（或量）取供试品适量，用各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。
双碟的制备
取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（照表 1）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm
