红细胞生成素受体研究进展

　　红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是哺乳动物红细胞生成的主要激素调控子，对于红细胞前体细胞的生存、生长、分化、成熟具有重要的作用。为了进一步探讨EPO作用方式，有必要对其和其受体的相互作用有深入的了解。但由于这些受体数量的稀少和表达的不同阶段性，使得研究受体有很大阻碍。1989年鼠EPO受体（EPOR）的克隆解决了这一关键性难题，这使得人们开始利用各种克隆表达体系对EPOR的结构、蛋白性质、表达调控和信号传导问题有了深入的了解。通过克隆鼠和人EPOR在两方面取得了重要的进展：首先，EPOR的结构表明，它的膜外域包括4个共分布的半胱氨酸和预测的成对的β-链配体结合域，以及近膜区疏水的wsxws结构。这都说明EPOR是造血受体超家族的成员。其次，人鼠受体的克隆使得人们有机会通过转染实验和造血细胞系突变，受体功能的重建来确认调节增殖信号功能域和辅助因子，从而使人们更加细致地了解细胞的信号转导。而EPO介导的分化则尚未在模型系统中得到重现。这一领域研究对象模型仅限于红白血细胞病细胞系或分离的正常红细胞前体细胞。可以说，这方面的问题是今后克隆表达技术完善的一个突破口。本文从EPOR克隆技术的发展、EPOR的结构、功能、复合体的形成、hEPOR基因的表达调控、EPO介导的信号转导、EPOR在医学研究中的应用这几个方面作一个回顾性的介绍。

　　1 EPOR的克隆

　　EPOR的克隆是由于当时对红细胞生成素引导的红细胞增殖分化的了解甚少，而且这至少在一定程度上是由于普通红细胞与红白血细胞系表面受体过少（不足1000 ePOR/细胞[2]）所致。最早的开创性研究在1989年[1]，通过cos细胞表达战略来完成了鼠EPOR的cDNA克隆。

　　这项研究工作是从表达EPOR的鼠MEL细胞构建一个cDNA文库，而后将其转染至cos细胞。通过对125I-EPO的结合与吸收来筛选cos转染子。这种方法一共筛选了两个克隆：克隆141（19kb），克隆190（18kb），且酶切图谱相同。而后又将其亚克隆至M13mp18或M13mp19载体，用链终止法确定了其核苷酸顺序。此研究的意义在于①揭示了mEPOR的编码核苷酸顺序，即单一的开放型507bp的阅读框架，3’端另有167bp，且有poly（A）尾巴；②EPOR有3个结构域，即N端含有24个残基的典型信号序列的胞外域，以α螺旋形式的膜区及胞内区；③有2个N端基化位点，一个在胞内，一个在胞外；④交联反应发现了另外两个与EPO交联的蛋白，分别为85×103、100×103；⑤MEL细胞仅有单一纯合性的受体，而cos细胞则有高低两种亲和性受体，分别占14%、86%。

　　随着小鼠EPOR cDNA的表达克隆，使得人的EPOR的结构研究成为可能，通过mEPOR的序列而设计成的探针，1990年[2]筛选人胎肝cDNA文库克隆出一个编码人75%EPOR序列的克隆ER2 cDNA，并筛选基因组文库克隆了编码5’外显子序列的基因组DNA，将二者信息合并，推导出人EPOR的一级结构。

　　此工作的意义在于：①证明了人EPOR共有508个氨基酸，分子量为55.24×103，其序列与小鼠有82%的同源性；②利用ER2所做探针通过原位杂交技术确定了人类EPOR基因位于19p位置，并证实有些人红白血病细胞系（TF-1），其19p上有多余的基因物质。这在病理学某种程度上阐述了EPOR基因结构或表达方面的异常对于红白血病的致病有着重要的意义。

　　这方面的同期工作还有[3]，EPOR的cDNA从由OCIM1细胞提取poly(A)RNA组建的cDNA文库中筛选，探针亦为mEPOR的酶切片段（克隆190）[1]，并辅之以用人胎肝cDNA文库中EPOR cDNA PCR扩增产物做验证。克隆出了18p片段，编码EPOR的全长。并证实，与小鼠的糖基化位点不同，hEPOR的胞内域缺少N-糖基化位点。两次工作也都表明cos细胞中表达的受体都是66X103，与计算的差异可能是由于糖基化所致。

　　以上所及都是针对EPOR cDNA克隆所言，随着其编码序列的确定，人们开始把EPOR基因克隆与cDNA克隆相结合[4]，从而第一次较全面地使人们认识了EPOR的整个基因结构，并为以后的表达调控研究奠定了基础。

　　基因组的克隆一般采用人胎盘EMBL3文库，用hEPOR cDNA作探针，而后将克隆再亚克隆至puc18载体，从而进行测序，其外显子与内含子序列的边界则由OCIM1 mRNA的PCR克隆所得的cDNA序列相比较而[4]确定。对于cDNA文库的克隆，同时期的工作编码，所使用的两个人cDNA（骨髓，胎肝），其获得的EPOR cDNA克隆通过与mEPOR cDNA的和hEPOR的全序列综合比较，发现所用的人cDNA都是非正常的，它们都包含着额外序列或未切割的内含子、异常插入序列，内含子外显子交界处的新插入序列。

　　EPOR cDNA和基因结构表明，hEPOR的基因位于19p，接近着丝点。共有8个外显子和7个内含子。外显子包括5’非翻译端、信号肽区域及胞外域的氨基端域。外显子6编码单一的跨膜区。胞内区由外显子7、8编码。外显子的大小是从87bp(外显子6、7)到大于800bp（外显子8）；而内含子序列从0.08kb到2.1kb，并包含与Alu高度同源的重复序列。此基因3’端不包括poly(A)加尾信号（AATAAA）。人、鼠EPOR基因有着高度的同源性，这主要体现在它们的编码序列和5’端调控枢。5’端小鼠序列在-146bp和-147bp位置包含转录起始位置，人与之对应于-133、-134或-137bp位置。另外人序列从-146～-185bp与小鼠-161～-200bp有80%的同源性，并且包括可能的调控序列SP1结合域（CCGCCC），造血细胞系特异转录因子GATA-1结合域（TTATCT）。hEPOR序列从-80～-104bp包括一个回文序列（CAGCTGCGTCCGGCGGAGG-CAGCTG），这一点与小鼠不同（小鼠没有回文序列）。另外比较重要的一点是，人EPOR不包括CAP位点上游的TATA或CAAT序列，而这个位点通常为转录因子和RNA聚合酶结合位点，来支持转录的基础水平。

　　2 EPOR的蛋白性质、结构、功能域及复合体的产生

　　EPOR DNA被克隆后，从序列长度推算其分子量为55.24×103。 但从细胞上分离下来的EPOR分子量为64×103或66×103。这往往是糖基化的缘故。但1993年的研究表明，EPOR的功能形式是一种78×103的分子[5]。这基于以下几种事实：①HCD57小鼠红细胞当缺乏EPO刺激时，出现78×103的EPOR增多；②用抗NH-端抗体探寻这些细胞的完整表面时只发现78×103的EPOR；③酶促脱糖基化、脱磷酸化表明，这种EPOR是62×103EPOR的N端糖基化所致；④抗磷酸化酪氨酸抗血清处理时，发现这种78×103EPOR的磷酸化是依赖EPO刺激的，且在EPO刺激下，这种受体的代谢速率比没有EPO刺激时要高；⑤COS细胞暂时表达EPOR cDNA，发现除64×103、66×103两种预期受体外，可能还有微量的78×103EPOR存在。也许正是由于功能受体的微量才导致COS细胞没有EPO应激反应性[1]。

　　EPOR的最初基本结构由克隆的鼠的EPOR来解释，其编码507个氨基酸残基，且有一个类型1的跨膜蛋白域。前24个氨基酸残基形成一个信号肽，而其余的483个氨基酸残基包括胞外223个氨基酸残基的激素结合域，24个残基的跨膜域和236个氨基酸残基的胞内域。胞外域有造血受体超家族共有的两个特征：一套4个的半胱氨基酸残基和一个Trp-Ser-X-Trp-Ser的近膜结构。同时具有这类特征结构的其他细胞因子受体包括：IL-2、3、4、5、6、7、9，GM-CSF，LIF，GH，催乳素，神经因子等。

　　EPOR共有3个功能域，通过EPOR的胞外域与IL-3Rβ113胞内域组成的嵌合体的研究发现[6]。它们都能赋予表达细胞（Ba/F3）的分化特性。这表明受体的胞外域实际上是EPOR的关键分化功能域。而通过对EPOR胞内不同区域的删除发现两个功能相反的区域；近膜的大约100个含丝氨酸的区域传导增殖信号，而远离羧端区域下调这一信号，起到负调控的作用，具体位置大约在羧基端40～90个残基的区域内[18]。

　　以上是克隆cDNA的基本结构。但随着克隆表达的研究及与125I-EPO交联分子的综合研究发现，组成EPOR复合体的不能单纯认为是这一种分子。通过对红细胞系前体细胞和红白血病细胞结合EPO的交联研究。发现这两种细胞中除66×103（已确定为EPOR cDNA产物外），尚包括两种主要蛋白，分别为85×103～95×103和100×103～115×103[7]的两种蛋白。关于这两种蛋白有许多争议。Minraetal提出105×103和66×103均为克隆的mEPOR cDNA表达产物；而95×103则由另一个基因编码；但另一实验表明[9]，当将EPOR cDNA转染入IL-3依赖的细胞系如FDC-D1细胞或BaF3细胞时，EPO可以通过DSS交联p85、p100两种蛋白，而当这些细胞转染p66的截除形式时，EPO交联的分子量没有改变。这有力地说明了p85和p100蛋白不是由转染的EPOR cDNA衍生而来。

　　为了更好地反映EPOR复合体的真正结构组成，有人设计了将人EPO-反应细胞系和非造血细胞转染hEPOR的细胞交联反应比较实验[9]。结果发现85×103和70×103蛋白在AV-1细胞和COS细胞（非造血细胞系）中与EPO交联而没有发现105×103蛋白。显然，105×103EPO结合蛋白在造血细胞系中表达而在非造血细胞系中不存在。这个蛋白一定是尚未发现的基因的产物，它对于阐明EPOR的整体结构有重要的意义。

　　另外EPO刺激细胞产生分化反应，通常有两种kd值（亲和力的标志）大小的受体，分别是0.04～0.1nmol/L（高亲和性 ）和0.4～20nmol/L（低亲和性）。而当把小鼠红白血病细胞的EPOR（只有一种亲和性）转染到cos细胞（无内源EPOR表达），两种类型的受体均被表达[1]。当把只含有低亲和性的受体的IW201细胞与非转染的细胞融合时，才产生高亲和性的受体[4]。研究又发现，EPO依赖的增殖需要低亲和性的受体，而红细胞系的分化需要高亲和性。这都使得人们猜测存在一个附加分子于EPOR复合体上，使得EPOR的亲和性提高，从而调节细胞在EPO的刺激下增殖、分化[10]。

　　以上勾勒出当前对EPOR复合体组成研究的大概轮廓。但对于复合体的形成与激活则落实到对EPOR的二聚体化的研究和WSXWS结构功能的研究上，且WSXWS结构作为造血受体超家族的一个重要的共同组成部分受到高度的重视。目前对其研究方法基本上是EPOR cDNA突变战略[10]。例如[5]，把WSXWS部位进行删除、插入而导致突变的EPOR导入IL-3依赖的造血细胞系BaF3发现，细胞表面几乎失去结合EPO的能力并且在EPO刺激下亦不生长。突变的受体被滞留在内质网中，这种情况下，即使用Arg129代换Cys点突变[11]（往往造成细胞组成型激活），亦不能使受体激活。鉴于不能运出内质网的多肽往往是由于不能正确折叠[12]，抑或因为某些聚体蛋白亚基不能组成复合体，人们有理由认为WSXWS结构对EPOR正确构象的形成，蛋白体的组装，配体的激活等具有重要的作用。进一步的研究表明[8]，用cos细胞分别表达将WSXWS中一个氨基酸代换的产物，表明能转运到细胞表面的突变子其激活EPOR亲和性亦正常，且以正常速率内化EPO，并转导正确的增殖信号。如将W以外的氨基酸代替中间的氨基酸，cos细胞全部正常表达，同时也发现一个突变子A234E比野生型EPOR的加工效率更高且在细胞表面表达量更高，而WSXWS结构单点突变不能赋予细胞独立于生长因子的能力。这从侧面反应出WSXWS结构不是决定信号转导的功能单位，不能作为激活EPOR复合体的主要因素。

　　完整的复合体的产生意味着EPOR的激活。目前为止共有4种不同机制激活EPOR的增殖功能：①结合它的自然配体EPO；②结合鼠的红白血病逆转录病毒的env基因产物gp55；③EPOR胞外域R129C的点突变[11]；④双价EPOR抗体对其激活[13]。后3种对揭示EPOR激活复合体的形成机制具有重要的意义。gp55能激活EPOR，但它的激活位点和EPO的不一致[4]，且当EPOR和IL-3R组成的嵌合体在Ba/F3细胞表达时只有那些含有EPOR的跨膜区域的EPOR才被gp55激活，说明gp55和EPOR作用需跨膜区域。也说明跨膜区域可能是形成复合体的一个功能域。而R129C突变子使EPOR形成二硫键交联的二聚体，使细胞不依赖EPO刺激组成型激活，这在某种程度上表明，EPOR（R129C）的同源二聚化摹拟了野生型与EPO结合被激活的情形。1996年有报道，双价EPOR抗体使EPOR在膜上交联，使得受体激活，提出了细胞因子受体的多聚化是激活的一种模式[13]。

　　综合以上资料，提出EPOR复合体的工作模型：即EPO激活EPOR导致两个单体的二聚化，每个单体分子量为72×103或78×103（因为这两种分子在细胞表面都有发现），并且以某种方式与105×103或85×103两分子相连，同时由于附加分子的结构使受体呈现出高低两种亲和性。这个模型是综合最近研究进展对于1992年模型[15]的修正。它的合理性与否需进一步实验加以验证。

　　3 hEPOR基因的表达调控

　　EPOR在红细胞系成熟的早期阶段表达较少。具体说来在体外红细胞系早期识别EPO的细胞为BFU-E，其细胞表面无EPOR，生长不受EPO调控。BFU-E与IL-3或GM-CSF共同培养48～72h后，细胞逐渐成熟。细胞表面出现少量EPOR，4～5日后，形成CFU-E，而EPOR的表达数量达到顶峰[17]。这时的EPOR对EPO极度敏感，并不断增殖、分化、成熟。随着CFU-E的成熟、分化为原始红细胞，早幼红细胞，EPOR量逐渐减少。可以看出在整个红细胞生成过程中，EPOR基因受到了严密的调控。

　　那么，有哪些顺式元件和反式元件负责这些事件的发生呢？通过对hEPOR基因5’端的序列进行一系列的敲除、重新构建并转染细胞发现[16]，一段跨越-1050～+135（+1是转录起始的CAP位点）的序列的是最重要的调控顺式元件，并可以通过用转染红细胞系（HEL）、非红细胞系（HELA）的报告基因的表达情况[16]将这一区域分为转录活动的最小启动子：从-76到+33段。它包括GATA-1和一个SP1的结合位点（分别在-45，-20）。但仅仅这两个顺式元件的相互作用尚不能指导红细胞系的特异性hEPOR的表达，资料表明，当GATA-1蛋白表达载体和低活性的△SP1质粒共转染OCIMI细胞（红细胞系细胞）时，可以发现增加的GATA-1造成了细胞转激活。Sp1、GATA-1和其他细胞特异性因素的协同作用可能是高水平阶段性激活的重要条件。现在有报道[16]，红细胞系特异表达是由-76、+135片段结合其他至少两种核蛋白（U3，U4）（+35，+85）决定的，因为这个片段构建的转染子HELA细胞表达出基本的受体水平。从而决定了（-76/+135）片段是红细胞系特异最小启动子。

　　在转录起始位点的下游，从+79到+135为负调控区，并且在+85位点结合有SP1；第二个负调控区从-1050到-450，其中包括Alu重复序列，在这一负调控区域鼠和人都是距转录起始位点1kb左右，并且Alu在许多基因的调控上有转录抑制作用。

　　+1、+78区域为正调控区，结合蛋白具有典型的螺旋-环-螺旋结构。

　　在-40位置为结合hGATA-1的转录激活部位，并且在-70/-215有几个潜在的GATA-1结合，其作用不详。

　　在具体的顺反元件作用机制上现有一种双重正反馈环说法，即EPO的刺激使CFU-E和前红细胞的红细胞系蛋白（如U3、U4）被引导或激活，而且CATA-1本身也能激活其自身基因。这种机制对于阐明红细胞系分化的遗传信息的激活，并保持红细胞系的发展状态有一定的启示[18]。

　　另外在5’翼侧区及基因外显子1中，有DNaseI高度敏感位点，这是“开放”染色质的标志。 有理由认为这使得附近的基因和启动子元件可以更容易地接触转录因子。这都暗示这一区域对红细胞系特异性表达研究具有重要意义。

　　4 EPO介导的信号转导　

　　1989年EPOR的克隆使人们对EPO引发的红细胞系前体细胞系蛋白胞内早期事件有了深入了解。从主要对表达外源野生型或突变型EPOR的研究看，EPO能引起那些具有内源酪氨酸激酶结构域的受体才能引发的许多反应。而EPOR受体的结构是独特的：它只有一个多肽链参与与配体的结合；而其他造血生长因子受体需要2或3个亚基来保证最佳高亲和力结合[20]。EPOR胞内域并无酪氨酸激酶活性部分[19]，它的胞浆区236个残基的一部分与IL-2受体β链的胞浆区有一定的相似性，有两个保守区分别称为BOX1和BOX2。分别删除胞浆区近膜部分和羧基端部分并分别在受体细胞转染发现，近膜区具有正调控信号作用，而羧基端部分相反。随着研究的逐渐展开，克隆技术与生化免疫技术的综合应用，我们开始对EPO介导的信号转导的物质基础有了了解。

　　普通的红细胞系前体细胞表面只有50～1000个EPOR[21]。而EPOR cDNA的存在使外源导入的细胞表面有10000-20000个EPOR，这就意味着在EPO刺激下能更容易观察到细胞内部的变化，研究所用的转染细胞系通常为IL-3依赖的造血细胞系，它们细胞表面没有内源EPOR。把野生型EPOR导入这些细胞，赋予了它们在EPO刺激下增殖的特性。这使得研究者能在不考虑内源性EPOR贡献的前提下评估各种突变EPOR的诱导作用。但由于骨髓细胞系的蛋白组成和红细胞系前体细胞的有许多不同，这些研究结果可能因不适用红细胞系细胞而加以修正。但有实验表明用具有内源性EPOR的细胞系产生了与骨髓细胞相似的结果，证明了这一克隆表达实验模型的可能性。

　　研究表明，尽管EPOR不具有内源性酪氨酸激酶活性。EPO能诱导许多蛋白酪氨酸磷酸化，其中有7个最显著的磷酸化物：①与Shc相连的p145，这是一种含有SH2结构的四磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的5’磷酸酶[22]，它被命名为SHIP；②与EPOR相连的酪氨酸激酶，JAK2（p130）26[16]；③信号转导和转录激活子5（STAT5）（p93）[11][13]；④EPOR本身（p72）；⑤p70，这是一种重要的磷酸酶，称为HCP或SHP，它具有使JAK2脱磷酸化，从而导致EPO刺激信号下调的重要作用[23]；⑥Syp与激活的EPOR受体相连，促进有丝分裂[24]；⑦SHC的异构形式：p52、p46[25]。

　　通过这些发现，EPO引起的早期信号事件可以概括如下。一个单一的EPO分子使两个EPOR分子形成二聚体。先前已经附着于EPOR上的JAK-2分子可能通过和另一个JAK-2相互作用而激活[26]，但是有资料表明，这种作用依赖于EPOR的转录后修饰。78×103或72×103EPOR的额外糖基化可以使JAK的相互作用更加便利。而且78×103EPOR的丝氨酸可能是影响JAK-2与EPOR的因素（它的存在增加了EPOR与JAK-2亲和性）。随后JAK-2自身磷酸化。激活的JAK-2使EPOR胞内域8个酪氨酸部分或全部磷酸化，而后这些磷酸化酪氨酸通过胞内蛋白的Src同源2区（SH2）来吸引它们到EPOR上，并且同时导致这些蛋白酪氨酸磷酸化（大多数是被JAK-2[27]）并被激活，例如Shc[22]，磷酸脂酶Cr（PLCr）[6],STAT5[18],HCP(25,26),Syp[28]，磷酸肌醇3-激酶[29]；或者使酪氨酸磷酸化而导致其失活，例如GATase激活蛋白（RasGap）。这一系列事件导致了目标细胞发生一系列反应从G1期向S1期过渡。

　　为了弄清这些反应对EPO引发的增殖和分化的相对重要性，人们开始把确定哪种SH2包含蛋白和EPOR的哪一个磷酸化酪氨酸结合作为研究的起始点。通过把特定位置进行点突变的EPOR导入细胞，并以此研究相应蛋白与结合并被激活的情况，逐步搞清了这种对应情况。如将Y425F的突变EPOR导入DA-3细胞并表达发现，EPO刺激引发的Syp酪氨酸磷酸化程度下降，并且DA-3细胞生长情况比表达野生型EPOR的细胞要好。这些结果表明，Syp通过其SH2区域与EPOR的磷酸化的Y425结合，而后JAK2催化酪氨酸磷酸化[24]。同理发现，EPOR胞浆区的Y453是HCP的结合位点[23]；Shc和EPOR羧基末端的7个酪氨酸不止一个地结合[30]。PI3激酶通过其亚基p85与EPOR的Y503结合[29]。而JAK-2的结合区域，通过将EPOR受体近膜胞浆区域20个氨基酸的删除或将Trp282进行点突变Trp-Arg，则不能发现JAK-2与突变的受体结合，这一切表明至少近膜区的20个氨基酸（从280～301[20]）是JAK-2一受体的连接部位，且这一区域可能毗邻EPOR的正调控区[18]，其缺失使细胞丧失有丝分裂功能。也可以看到JAK-2在EPA介导的增殖信号传导特别是早期信号转导中有着重要的作用。

　　与JAK-2的作用相反，Hcp(SHP1)是结合于Y429的负调控区。它的具体作用形式是使JAK-2脱磷酸化，从而导致EPO刺激信号的下降以致消失。而Syp除了与激活的EPOR相连外还和那些受体酪氨酸激本团、非受体激酶相连，如PDGF受体、cKit受体、EGF受体、IRS-1等相连，且其SH2域的高亲和序列为PY-V/L/T-X-V/L/I[18]，可见它也是信号通路中非常重要的一种蛋白质。其他还有PI3激酶，加上非SH2蛋白RasGAP，说明磷脂酰肌醇通路亦在EPO信号通路中具有重要作用。

　　以上大部分问题的研究都是基于IL-3依赖的细胞系表达外源野生型和突变型EPOR进行。尽管这对于确定EPO引发的事件很有用，它们仍限于那些只对于EPO增殖的细胞。而正常的红细胞系前体细胞则兼有增殖与分化两种特性。这就启发人们来发展“第二代”细胞系，使之完全或部分接近正常的红细胞系前体细胞。这样就可以区分哪些事件促进分化，哪些事件促进增殖。可以说这是对EPOR克隆表达技术应用又一新的挑战。

　　另外关于分化方面的研究揭示人cord血细胞在EPO刺激下， Ga++内聚（胞内、胞外流入），而在表达外源EPOR的非红细胞系细胞中不能发现Ga++流入，这说明Ga++的变化对于成红细胞的分化、成熟过程有重要的作用。类似的实验还发现cAMP的增加是分化过程的普遍现象，而在增殖过程中并不出现，还发现原癌基因myb的表达使分化作用得以加强。这些线索的发现为以后EPO信号转导通路在红细胞系分化中的研究打开了突破口。

　　5 EPOR在医学研究中的应用

　　随着有关EPOR克隆研究的不断深入，及对EPOR功能域分布、信号转导机制的逐步了解，人们对各种造血疾病的病因开始了研究。

　　大量的证据表达EPOR基因在由“Friend”病毒诱发的小鼠红白细胞增多症的发生中起着作用[31]，脾点形成病毒（SFFV）的“env”蛋白与EPOR结合将其激活，导致早期Friend病毒疾病特有的成红细胞多克隆增殖。此外，在Friend细胞系FCL1中现[32]，SFFV长末端重复片段插入激活EPOR基因。另一个相似而又不同的插入事件在FCL1细胞中亦出现[33]。而将小鼠EPOR的R129替换成 c129则导致EPOR的不依赖配体组成型激活，并且能导致体内肿瘤的产生。

　　目前通过利用生化与EPOR克隆技术来探讨人类白血病与红细胞增多症的研究取得了可喜的进展。TF-1是从自然发病的红白细胞增多症病人中提取的一种细胞。这些细胞表达高水平的EPOR。通过核型分析发现在EPOR的基因位点19P13.3出现19+。而酶切图谱显示EPOR的5’端基因排序正常，而在外显子和3’下游部分非正常。这说明有外部遗传物质插入。用以前hEPOR克隆出来的ER-2（EPOR cDNA）作S1核酸酶切保护探针进行核酸酶切分析TF-1细胞中的转录产物，从而精确地确定出FPOR的基因有关中断位点图谱。中断位点位于转译终止密码子5’端303核苷酸位置，这导致了EPOR羧基端大约100个氨基酸的缺失或替换，而易位到此的染色体物质可能通过异位增强了EPOR的高效表达。

　　与此类似，Sokol等人在原发家族性或先天红细胞增多症（PFCP）的研究中[34]发现在EPOR的核酸序列5975处插入一个核苷酸G，可导致自编码子430开始的移码突变，使蛋白编码提前终止，造成64个氨基酸的缺失。为了进一步验证，将这种称码突变的EPOR 5974 insG转染到Ba/F3细胞中从而使其对EPO高度敏感。这次克隆细胞的成功证实了EPOR突变PFCP的致病机理，特别是在它具有家族性和遗传性时开始着眼点放在对EPO基因的结构上。

　　同期类似的工作成果还有由于EPOR基因6002处G突变成A导致无意义突变，生成了一个终止密码子TAG，结果蛋白产物的下游70个氨基酸被截去造成了截断产物的出现，使继承性良性红细胞增多症产生。

　　从以上资料可以看出各种突变造成的疾病实际上都是由于EPOR末端的缺失而对EPO的敏感性变化。这些证明了这一羧基末端的功能是负调控性的。它保证了红细胞系的正常分化、成熟。

　　关于EPOR在临床上的应用研究现在报道并不多见。在逆转录病毒介导下将EPOR和白介素9受体分别导入高度纯化的造血干细胞/前体细胞（HSC/HPC）从而使可检测的细胞因子反应性红细胞系前体（BFU-E）增多。而后又将这2种基因同时导入时发现BFU-E的数目进一步增多，而且这些前体细胞的增殖特性亦得到进一步加强。这些结果对进一步明确HSC/HPC的增殖分化功能且在探讨EPOR辅助其他细胞因子的基因治疗方面具有较大的意义[27]。

　　结合关键部位的确认有助于设计能模拟天然配体的药效基团。突变研究拓展了在受体-配体结合动力学中关键氨基酸在三维构象中作用的信息。目前，EPO受体结合肽库筛选方面的研究不仅使人们找到了EPO作用类似物而且对于受体本身的“表位”结构亦有所发现。

　　通过合成的寡核苷酸的复合物克隆到显示载体噬菌体显示系统而合成了大量的多肽库，这些多肽与噬菌体外壳蛋白融合。而后用CHO细胞克隆的EPOR的胞外域的融合蛋白进行筛选，发现一系列的相关多肽与EPOR有较强的亲和力。还发现，这些多肽配体与EPO的初级结构并无同源性。一个代表性的多肽（EMP1）其引发的酪氨酸的磷酸化与天然hEPO的活性并无二致。更重要的是这些激活子的特性经受了体内红细胞生成模型的验证。其作用机制是，当激活细胞表达EPOR胞外域（ECD），多肽促进了复合体衍射晶体的形成。这个晶体的分辨度为2.8A[35]。两个肽分子分别与受体亚基结合，同时近乎对称地双聚合受体。这也证明了受体二聚体化对信号激活的作用。令人鼓舞的是EMP1在小鼠血浆中的半衰期为8小时，这至少部分地说明，这种多肽有能力在体内产生影响[35]。而用鼠EPOR胞外区免疫得到的单抗IG3筛选肽库发现，所得的小肽正好与人、鼠EPOR的6～11位氨基酸残基排列（LeuProAspProLysPhe）相同，这说明EPOR的“表位”只决定于这6个氨基酸残基[36]。

　　应该看到造血系统许多疾病的病因至今尚不清楚，但由于分子生物学技术的应用尤其是克隆技术、免疫技术、生化遗传分析技术使我们透过EPO受体开始在这一领域打开了一个突破口，从这儿展开找到各种疾病的病因，设计出更加有针对性的药物，建立更有价值的转基因动物模型，这些都是有关EPO受体今后的研究趋势。

　　6 问题与展望

　　从1985年EPO克隆到1989年EPOR的克隆，人们对于最重要的造血因子及其作用机理从基因水平到疾病的病理、临床药物的开发作了大量而细致的工作。本文对从1989年到1996年有关EPOR研究的主要成果作了大略描述。可以看出，我们现在对EPOR的结构、各部分功能域的功能、位置，受体复合物的形成，EPOR在体内的表达调控，信号传递的机制，因结构的异常引发的各种疾病及机理和临床药物的研究方面有了大概的认识。应该看出EPOR的克隆尤其是cDNA的克隆表达在其中起了巨大的作用。在研究中我们经常可以看到对EPOR进行点突变或者插入、删除进而研究EPOR的配体结合域，信号调控域及多种表达体系，这包括多种造血细胞系的衍生细胞系、非造血细胞系（BF-1，DA-3），还包括工程细胞系如CHO、COS细胞等。大肠杆菌对于EPOR的胞外域的研究亦起到重要的作用。

　　同时我们亦应该看到多种细胞系的选用都是针对于某一个方面或问题而决定，而在对造血细胞系的整体分化、增殖、信号传递方面尚未选择出某一种细胞模型。例如COS细胞，这种研究应用最广泛的细胞虽然能表达EPOR受体，但本身并不对EPO发生应答反应。许多表达EPOR的细胞系往往仅发生增殖反应，而不象红细胞系那样随着时间的推移而发生阶段性增殖、分化反应。可以看到寻找近似表达体系模型是EPOR克隆表达技术今后的一个突破口，它的发现必然带动一系列重大问题的突破。

　　当前许多细节问题没有解决。例如EPOR复合体的形成问题，细胞表面78×103和72×103EPOR各自功能及相互关系的问题；高亲和力受体如何形成；信号传递中下游信号如何继续传递；其他同类细胞因子尤其是白介素类因子（如IL-3，IL-9）在信号传递上究竟有何关联；原癌基因有哪些、并如何对增殖分化产生影响；各种胞内酶如何有机地配合受体完成信号功能等等。

　　另外，1992年[37]发现EPOR并不是一直完整地出现于红细胞系，它的截然形式在红细胞前体细胞的早期占据了绝大多数，而全长的EPOR在前体细胞的晚期则成为主要存在形式。转染EPOR-T的细胞比表达全长（EPOR-F）更容易发生细胞凋亡，但能使之发生细胞有丝分裂。可见EPOR-F可传导信号阻止程序性细胞死亡，而细胞有丝分裂则独立于衰亡。亦说明EPOR基因的选择性切除在红细胞生成中具有重要的作用。

　　有关EPOR的增殖、分化、凋亡研究已经展开。我们亦期望着克隆技术取得重大进展来完善对红细胞生成这一复杂问题的认识，并最终完成各种临床药物的设计来治疗诸如白血病、慢性肾衰竭贫血、化疗导致贫血、AZT治疗艾兹病导致贫血等症状的目的。