结核病分子生物学研究进展

　　1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型是现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。所谓分子生物学是指从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律。医学分子生物学是其中的一个重要分支，它是以疾病为中心，用分子理论和技术来研究人类疾病的预防、诊断、治疗和发病机制等。早在19世纪，人们就已知道结核病的致病菌是结核分枝杆菌，研究人员对结核分枝杆菌的形态、生长特性等进行了充分的研究。20世纪90年代以来，随着分子生物学在医学领域取得的飞速发展，研究者也将分子生物学的原理引入了结核病实验研究范围。因而，结核病分子生物的研究也主要是从分子水平来研究结核分枝杆菌基因组、结核分枝杆菌致病机制、结核分枝杆菌耐药性机制等，再在这些理论研究的基础上开展结核分枝杆菌分子生物学检测的研究等。本文拟在结核杆菌分子生物学理论及分子生物学技术上做简单的综述。

　　1  结核杆菌分子生物学基础理论的研究

　　1.1  结核分枝杆菌基因组  1998年英国Sanger中心和法国Paseteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作［1］。结核杆菌全基因组序列由4.41Mb(4.41529bp)组成，包括4411个基因，具有潜在编码能力的基因约有3977个，约占90.2%。有3924个开放阅读框，其中约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤独序列，与其他微生物的序列无相似性。基因组富含GC碱基，G+C含量高达65.6%。2001年10月，完成了对结核杆菌CDC1551全基因组的测序工作。结核分枝杆菌全基因测序工作的完成为结核病病原菌致病基因的各种研究提供了极好的机遇。

　　1.2  结核杆菌耐药基因的研究  20世纪中叶以来，各种抗结核药物相继问世，加之人们生活水平的提高、卫生设施的改善等，结核病的发病率持续下降。然而，结核杆菌很快对各种药物产生了耐药性，结核病在沉寂了一段时间后又死灰复燃，给结核病控制工作带来了新的挑战。从结核菌的结构本身上来讲，它具有几种抑制抗生素活性的机制。首先，它被其特有的、高疏水性的细胞壁保护，大大降低了化合物的渗透性，这就构成了结核杆菌对药物的第一道防线。另外，在结核杆菌中发现了活跃的药物外排系统、使药物降解或失活的酶以及与这些功能相关的基因。结核杆菌的耐药性形成机制有适应学说、选择学说、遗传学说，遗传学的研究表明结核杆菌产生耐药性的根本原因在于基因突变。在自然条件下，基因突变的几率非常低（一般在10-8～10-5）。其中结核杆菌针对异烟肼和利福平发生突变的几率分别为10-6和10-8，发生多耐药性突变的几率为10-14。

　　基因学研究表明，结核杆菌耐药性的产生多见于染色体上编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因突变所造成。目前对结核杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。现已研究清楚耐药性有关突变形式，有点突变、缺失、插入突变等，这些形式在抗结核一线药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素等）均已出现［2］。

　　1.2.1  结核杆菌耐利福平（RFP）分子机制  RFP作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶β亚基（rpoβ），与它特异性地结合，抑制聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。近年来的研究表明，结核分枝杆菌耐RFP的发生是由于编码RNA聚合酶聚合酶β亚基（rpoβ)基因突变所致，而且集中在一段高度保守的81bp(507～533位27个氨基酸密码子）的区域内，此区域为核心区域又称RFP耐药决定区。最常见的突变点是第531位丝氨酸（Ser)与亮氨酸（Leu)置换，第526位组氨酸（His)与络氨酸（Tyr)、天门冬氨酸（Asp)或半胱氨酸Cys置换，第516位Asp与氨酸（Val)置换。临床分离耐RFP菌株超过96%是由于rpoβ基因突变所致，其中有65%～86%的突变发生在第531位和第526位，并引发高RFP水平的耐药（＞32μg/ml），而514、521、533位点产生的都是RFP低水平耐药（＜13.5μg/ml)。约4%左右耐RFP结核分枝杆菌的核心区域或rpoβ基因其他未知未发生突变，提示还有其他耐RFP机制存在，如发现在rpoβ氨基酸终止区域的突变与利福平的耐受性有关［3］。rpoβ突变已作为结核分枝杆菌耐RFP的遗传标志，并建立了多种快速、有效的检测耐RFP基因型的方法。目前，研究人员主要研究rpoβ基因不同位点突变与耐RFP表型之间、rpoβ基因突变与利福平最低抑菌浓度的关系等。这些方面的研究还有待进一步的深入。

　　1.2.2  结核杆菌耐异烟肼的分子机制  异烟肼属于前体药物，需要由结核杆菌体内的过氧化氢酶—过氧化物酶激活，从而产生一系列的活性氧和活性有机自由基攻击结核杆菌的多个靶点，结果造成一些蛋白靶点某些基团氧化或酰化使蛋白失活，从而导致菌体一些生理功能的丧失。INH耐药机制比较复杂，目前研究比较清楚的是细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系［4］，过氧化氢酶—过氧化物酶编码基因（KatG)和（或）烯酰基还原酶编码基因（inhA)或烷基过氧化氢酶编码基因（ahpC)或酰基携带蛋白（AcpM)及β酮酯酰合成酶的复合物编码基因（KasA)等。

　　KatG基因位于结核杆菌染色体上，含2223个核苷酸。临床分离耐INH的菌株中有42%～58%发生了KatG基因突变［5］，可有KatG基因的完全缺失（不到1/3），导致产生高水平的INH耐药［6］；大部分为KatG基因有突变（点突变、缺失或插入）［6］，约在40%的耐异烟肼菌株中发现了第315位（Ser—Thr)的突变，此位置的突变使得过氧化氢酶—过氧化物酶丧失了近50%的酶的活性，导致酶失去活化INH的能力，引起高水平的INH耐药性，但它保留的酶活性仍为菌体提供一定水平的氧化保护，可使菌株抵抗机体残留的抗生素。KatG其他位置上的变异，也可以导致细菌对INH产生不同水平的耐药性和保留不同的过氧化物酶—过氧化氢酶活性，对这些突变所起的作用还需要深入的研究。

　　InhA和KasA均属于分枝菌酸合成系统的酶蛋白，它们发生突变的位点通常位于启动子区域，也有少数发生在编码这些蛋白的基因中，突变最终导致这些靶蛋白的过量表达或者一些功能的变化。但这类突变引起的都是低水平的异烟肼耐受［2］。InhA发生的突变使得第94位的产物色氨酸被丙氨酸取代，这种取代使InhA与还原型烟酰胺二核苷酸（NADH）的亲合力提高，从而在一定程度上阻断了异烟肼对InhA的抑制，使菌株产生了一定的耐受性。对临床耐INH菌株的研究，在一些耐药菌株上可出现KasA基因突变［2］，但在一些敏感菌株中也发现了类似的突变，目前对于它在INH耐受中起的作用还不太清楚，有待进一步的研究。

　　在约10%INH临床耐药株中含有KatG基因突变的菌株中发现了ahpC基因的突变。INH耐药菌株中ahpC启动子区域突变将引起AhpC蛋白的过量表达，从而弥补KatG基因突变造成的过氧化氢酶—过氧化物酶活性的损失，以抵抗宿主巨噬细胞的氧化作用。AhpC和KatG是细菌中协同作用调节氧压的一个调节子的两个酶，该协同作用是与OxyR转录因素一起进行的。结核杆菌OxyR基因含有许多移码突变、缺失，本质上并无活性，是一个假基因，与结核分枝杆菌INH敏感性无关［7］。但OxyR调节蛋白在功能上是作为氧化—应激的感受器和基因转录的激活剂，它控制解毒酶基因的表达，如KatG和ahpC基因的表达。因而，认为AhpC和OxyR水平之间的关系是结核杆菌对INH敏感的原因［2］。

　　1.2.3  结核杆菌耐链霉素的分子机制  链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，它主要作用于核糖体30S亚基，诱导遗传密码的错读，抑制转译过程的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质的合成，发挥抗菌作用。研究表明，结核分枝杆菌耐受SM与编码核糖体30S亚基，S12蛋白的rpsL基因和编码16SrRNA的rrs基因突变有关。临床分离耐SM菌株约有80%可见rpsL和（或）rrs基因突变［8］，其中rpsL的突变率高于rrs。rspL基因最常见的是43位密码子突变，使Lys密码子（AAG）突变成精氨酸（Arg)，也可见88位密码子发生同样的突变，rspL的突变常引起高水平的耐药。rrs突变常发生于915区和530环区，它常引起中等水平的耐药。少数耐SM结核分枝杆菌分离株中发现双位点的突变，如rspL43位密码子和rrs513位密码子突变，rpsL88位和rrs904位突变。约25%～30%左右的临床耐SM分离株具有野生型rrs基因和rspL基因，提示可能还有其他耐药机制存在，可能与细胞渗透性有关［9］。

　　1.2.4  结核杆菌耐乙胺丁醇（EMB）的分子机制  乙胺丁醇是一种合成抗结核分枝杆菌活性的药物，它是一种阿拉伯糖类似物，作用于结核分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，阻断形成阿拉伯半聚糖，从而影响细胞壁分枝菌酸—阿拉伯半乳糖—肽聚糖复合物的形成，使细菌无法生成完整的细胞壁，同时还会造成分子菌酸的积累［4］。

　　研究表明结核分枝杆菌耐EMB与编码阿拉伯糖基转移酶基因embABC操纵元突变有关，该操纵元约10.201Kb，由embC、embA和embB三个基因组成。国外专家研究表明，69%耐EMB分离株有embB突变，其中89%又都发生于306位氨基酸密码子［10］，国内也有类似的研究结果。在许多EMB耐受的结核杆菌中都是embB第306位的密码子的突变，使得产物中的蛋氨酸被其他氨基酸取代。另外，也发现了embR基因的突变与EMB的耐受也有关；rmID基因的突变可能产生高水平的乙胺丁醇耐受［4］，但其具体机制还不太清楚。

　　1.2.5  结核杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）的分子机制  PZA是一种烟酰胺类似物，它可能是具有抗分枝杆菌活性的复合物的前身，需要经结核杆菌体内的吡嗪酰胺酶催化才能转化成吡嗪酸发挥杀菌作用。针对PZA的作用机制，很早就发现对PZA耐受的菌株通常都失去了吡嗪酰胺酶的活性。目前，已经测序出编码吡嗪酰胺酶的基因为pncA。资料表明，72%～97%耐PZA的分离株存在pncA基因突变，突变发生的位点可分布在启动子区域和结构基因的各种位置。pncA基因突变造成PncA蛋白结构改变，从而失去了将PZA转化成活性形式的能力，导致耐药。但一些对PZA敏感的菌株中也发现了pncA基因的突变［11］，也并不是所有对PZA耐受的菌株都发生了pncA基因突变，这也表明了对PZA的耐受可能还存在一些其他的机制［12］。也有资料表明，前体药物PZA缺乏吸收也是PZA耐药的一种重要机制，也是结核分枝杆菌独特的机制［13］。

　　1.3  其他方面分子机制的研究  目前，已知有关的结核分枝杆菌毒力相关的基因有：与细菌在宿主内繁殖有关的分泌重复蛋白（ERP）；具有溶血活性的溶血素（TlyA)；与细菌入侵、存活有关的Virs蛋白质（Virs)；与细菌在细胞内存活有关的过氧化氢酶—过氧化物酶（KatG)；与调控细菌在细胞内存活状况有关的Sigma因子家族（包括SigF）［14］等。近来，学者们重点研究结核杆菌持续感染的基因有以下几种。

　　1.3.1  编码异枸橼酸裂解酶的基因icl和aceA  已证明这两种基因的产物都有异枸橼酸裂解酶活性。当结核分枝杆菌感染机体后，感染由急性转入为持续感染，结核分枝杆菌就改为利用脂肪酸为碳源，而异枸橼酸裂解酶是乙醛酸循环中的关键酶之一。已有较多的报道异枸橼酸裂解酶在结核菌持续感染中起重要作用［15］。

　　1.3.2  编码环丙烷合成酶的基因pacA  环丙烷合成酶在形成分枝酶的索状结构中具有重要作用，用对pacA酶的抑制剂，可在持续期杀死细菌［16］。

　　1.3.3  Sigma因子家族（包括SigF)  有学者研究SigF可能与结核杆菌适应休眠状态和抵抗宿主防御有关［17］。

　　1.3.4  其他基因  如rel基因，有人认为rel基因编码的酶可能和持续期的到来及能与宿主长期共存有关［18］。

　　自从结核分枝杆菌全基因组序列公布以来，人们对持续期有重要作用的结核分枝杆菌编码基因将会有更多的研究，也有很多问题待解决，如结核分枝杆菌一些关键基因或产物是如何在持续期发挥重要作用的等。

　　2  结核分枝杆菌分子生物学检测研究

　　结核分枝杆菌分子生物学检测研究主要集中在结核病的诊断、结核菌耐药性的测定、分枝杆菌菌型鉴定等方面。常用的检测技术介绍如下。

　　2.1  DNA序列测定  DNA序列测定技术的原理是建立在变性聚丙烯酰胺凝胶电脉技术的基础上，将待测DNA片段用放射性标记而形成单链寡核苷酸，使其一端为固定末端，而另一端成为一系列相差一个碱基的连续末端。寡核苷酸产物在4种不同双脱核苷的反应体系中分别终止于不同位置的A、T、C或G碱基上，将产物于聚丙烯酰胺凝胶电泳重分离，放射自显影后从4种末端寡聚核苷酸梯子性图谱中，就可以直接读出DNA的核苷酸顺序。DNA序列测定技术已应用于以下方面。

　　2.1.1  结核分枝杆菌耐药基因型鉴定  该方法不仅能用于细菌基因突变的检测，而且能够确定其突变的部位与性质，是检测基因突变的最可靠的方法。目前，DNA序列测定已作为从基因水平进行MTB耐药性测定的金标准［19］。但对每一菌株而言，全部测定所有已知突变部位，需要多次反应，且自动测序仪价格昂贵，需多步操作，限制了其在大多数实验室的应用。所以该法常作为其他方法的参考方法，或与其他方法结合应用。

　　2.1.2  结核分枝杆菌菌种鉴定  利用PCR—DNA序列分析技术，即利用PCR扩增待测基因，以荧光素为标记物，然后用测序仪测序，根据所得结果即可将待测菌株分型［20］。PCR—DNA可灵敏、快速、可靠地测定分枝杆菌种特异型核苷酸序列，目前，用于菌种鉴定的核苷酸序列主要有16SrRNA和65kD蛋白编码基因。但由于测序的成本高，工作量大，所以在临床实验室很难开展。

　　2.2  DNA探针技术  核酸探针是指用放射性或非放射性物质标记已知的DNA或RNA片段，然后用这种已知的核酸探针检测样品中未知的核苷酸顺序，如有完全互补的核苷酸顺序，则按碱基互补的原则结合，形成稳定的DNA：DNA或RNA：RNA复合物，再经显影、显色或荧光检测的方法，将结合核苷酸的位置或大小显示出来。核酸探针技术的显著特点是高度的特异性，可用于结核病的诊断、菌种鉴定和耐药性检测等方面，但它的灵敏度不够理想，标本中至少需要104～105个细菌的DNA才能检测出来，而且不能直接检测标本［6］，所以一般将它和其他的技术结合起来使用，如将它和敏感性高的核酸体外扩增技术相结合已成为结核病诊断和研究的重要手段。

　　2.3  基因芯片技术  基因芯片又称DNA芯片、生物芯片，是目前分子生物学最前沿的方法，创始于20世纪90年代初。其基本原理是将大量探针分子（指已知的DNA或RNA片段）固定在支持物（玻璃、硅片等）上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获得样品分子的数量和序列信息。因为该计算是将大量探针同时固定在支持物上，所以一次性对样品大量序列进行检测和分析。

　　此技术在结核分枝杆菌的研究种可用于菌种的鉴定、耐药性的检测，基因组比较分析。如目前已发现了针对5种抗结核药物（INH、RFP、EMB、SM、PZA）耐药的相关基因，基因芯片技术就是将针对这些相关突变的探针固定在一张芯片上，只需少量样本进行一次杂交，就可获得某菌株对该5种抗结核药物的耐药情况。用基因检测结核菌耐药性，仅需要4h。国内外有多家单位用该法检测研究结核菌耐药性，但由于芯片制备比较复杂；样品的处理比较繁琐；又需要昂贵的仪器，检测成本高，临床实验室很难推广使用。

　　2.4  DNA指纹图谱分析  此技术的基本原理是用限制性内切酶消化结核菌染色体DNA上特定的核苷酸序列，在琼脂糖凝胶中电泳分离，再将限制性片段转移到尼龙膜或纤维素膜上，与带标记的已知DNA探针杂交，然后检测与探针同源的限制性片段的数目和大小的变化，以区别菌株。这些片段数目和大小的变化使每株分离株呈现特征性带型，即指纹图谱型。此技术通常用于菌种鉴定，从而可以调查结核病的爆发流行，调查结核病患者是内源性复发还是外源性再感染，药物敏感性的变化等流行病学方面的研究。

　　用于菌株分型的遗传标志必须具有菌株内稳定型和菌种内多样性的特点。目前结核分枝杆菌DNA图谱分析方法普遍插入序列（IS）或其他重复序列作为分型标志。常用的有IS6110、IS1081、间隔子寡核苷酸、串联重复序列、富含GC多态性重复序列等，其中应用最广泛的是IS6110。下面对各种分型标志做一简单介绍。

　　2.4.1  IS6110  它广泛存在于结核分枝杆菌复合群（MTBc)的染色体基因组上，属于插入序列IS3家族。它在结核分枝杆菌不同亲本的菌株种中IS6110的拷贝数和染色体位置是高度变异的，在菌株传播期间能保持稳定，使流行病学无关的菌株产生不同指纹图谱，因而，IS6110—限制性片段长度多态性（RFLP）已成为结核分枝杆菌DNA指纹分析的国际性标准化方法［21］。但这种方法也存在一些不足，一是对IS6110拷贝数少或无IS6110菌株难以进行菌株水平鉴定，二是操作过程较繁琐，需要先对临床标本分离培养，实验中还要进行Southern杂交，费时也长。

　　2.4.2  间隔子寡核苷酸  间隔子是断裂基因中所具有的非编码序列，基于结核分枝杆菌的顺向重复序列（DR），它是一含36bp核苷酸的短的重复序列，集中在染色体一个特殊的区域，DR之间常被一些不同的间隔序列（间隔子）分开（多态性）。间隔子寡核苷酸分型法也就是Spoligotyping分型法。该法能非常容易的区别牛分枝杆菌和其他结核分枝杆菌［21］；也常用于IS6110低拷贝数的菌株分型，还可用于结核病的诊断等方面。Spoligotyping分型法方法操作简单，可直接检测临床标本，而且检测结核分枝杆菌复合群的同时可对菌株进行分型，有利于调查结核病的爆发流行。

　　2.4.3  多态性串联重复和可变数目串联重复  多态性串联重复（MPTR）是结核分枝杆菌染色体中一种主要类型的重复DNA，由10bp的短串联重复序列而被5bp的非重复序列所分隔，有许多位点在他们的重复数目中显示出高度可变性，称之为可变数目串联重复（VNTR）。VNTR分型方法与IS6110—RFLP分型方法分辨能力非常接近，而且可对IS6110拷贝数较少的菌株进行分型。由于VNTR具有高度的稳定性和可重复性，且该法操作简单，能提供数字式的分型信息，可同时对大量样本进行分析，所以VNTR分型方法的应用前景很好。

　　2.4.4  富含GC的多态性重复序列（PGRs)  是由24bp核苷酸序列不相同的重复序列组成，被不同序列的1～30bp核苷酸分隔，有数百个拷贝，并在染色体中是相当稳定的，可用于菌株分型。

　　2.4.5  其他  如IS1081，它仅存在于结核分枝杆菌复合群中。

　　2.5  聚合酶链反应（PCR）  PCR诞生于1985年，由美国 Muliis等发明。PCR是一种根据脱氧核糖核酸（DNA）复制原理而设计的体外DNA或核糖核酸（RNA）扩增方法，由高温变性、低湿退火及适温延伸等反应组成一个周期，经过n个周期后，理论上可以获得2n双链DNA分子，使DNA特定区段大量扩增。此检测技术灵敏度高、特异性强、简便、快速，但也存在假阴性、假阳性、污染等方面的问题，研究人员对其进行了不懈的研究，使该技术不断得到改善，新的PCR及其衍生技术不断建立，常见的有以下几种。

　　2.5.1  非经典PCR技术的应用

　　2.5.1.1  逆转录PCR  RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA，然后对cDNA进行PCR，一个细胞中rRNA的数量是DNA的100倍，因此扩增产物增多，试验的灵敏度大大提高。该法敏感性和特异性均高于经典PCR，可用于结核病的诊断，但同样无法区别死活菌。

　　2.5.1.2  巢式PCR、半巢式PCR  巢式PCR采用内外两对引物，两次扩增。内引物是针对外引物扩增产物中的某一段序列而设计，即内引物以外引物扩增产物为模板进行第二次扩增，内引物具有菌种特异性，外引物具有分枝杆菌属特异性。通过两次扩增可以提高检测的灵敏度，也可以从临床标本中直接检出结核分枝杆菌。它的特点是快速、敏感性高，而且可用于分枝杆菌种属鉴别［22］。半巢式PCR是由巢式PCR发展而来，主要是内引物的不同，它是利用外引物中的上游引物与第三寡核苷酸链组成了内引物，它同样可以直接检测临床标本，用于结核病的诊断。还有由上述两种方法发展而来的单管平衡半巢式PCR，此法提高了扩增的效率，并有效控制了污染等。另外还有单管巢式逆转录PCR，它的特点是可区分死活菌，但技术还不很成熟，有待进一步的研究［23］。

　　2.5.1.3  PCR—单链构象多态性分析（SSCP）  该法主要用于检测结核分枝杆菌的耐药性。其原理主要是PCR产物是两条互补单链，各单链的碱基序列不同而形成不同的空间构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，单链DNA泳动速度即取决于DNA的长度，也决定于其序列组成与空间构象。如果单链DNA某一片段的碱基序列发生突变或存在多态性，则在凝胶中的迁移率会发生改变，而在凝胶上显示不同的带型，通过与标准株对照即可确定有无突变，但无法确定突变的部位和性质。

　　2.5.2  PCR与核酸探针技术的结合  该法是将PCR的较高的灵敏度和核酸探针的高特异性结合形成的新方法。

　　2.5.2.1  实时荧光定量PCR技术  也称分子信标技术，是近年发展起来的核酸定量技术，是在普通PCR扩增体系中加入与靶基因序列互补的双荧光标记探针，当靶基因存在时，产生荧光，荧光的强度与PCR产物量成正比，应用荧光光谱分析即可定量测定。该技术糅合了PCR的敏感性、分子杂交的特异性和光化学的精确性。用定量PCR方法可检测耐药菌株和敏感菌株间DNA量的微小差别，以此确定是否耐药［24］。

　　2.5.2.2  PCR分子灯塔技术  其原理是在PCR扩增过程中引入了荧光标记的探针，游离的单链DNA探针以一种茎环结构存在，环状结构与靶序列互补，茎环结构即探针两臂的末端分别连有荧光物质和能淬灭荧光的物质。茎环结构使两部分足够近，荧光物质淬灭，因而溶液中检测不到荧光。若探针与靶序列能发生杂交，茎环探针将伸展成线状，即可检测到荧光。该法适合于耐药性检测中检测点突变，Piatek ［25］等用该法检测了耐利福平的结核杆菌，显示了较高的特异性和灵敏性，分别为100%和98%。并且该法扩增、荧光探针检测一体化，快速且防污染，但所用的仪器价格昂贵，难以普及。

　　2.5.3  以PCR为基础的DNA指纹技术

　　2.5.3.1  PCR—限制性片段长度多态性分析（RFLP）  其原理通过PCR扩增含有中特定酶切点的DNA片段，该片段经限制性内切酶消化后，产生较小的DNA片段，再电泳分离可形成结核分枝杆菌DNA指纹图谱。这是一种最早使用的基因分型方法，该方法操作简便，分辨能力高、图谱相对稳定，但电泳时往往条带难以区分，实际使用起来比较困难。该法也可用于检测耐药基因，如Mokrousov Ⅰ等利用该技术检测耐INH菌株的基因突变［19］。该法是针对结核分枝杆菌基因组DNA上特征片段，如插入序列IS6110、IS1081，多态性富含GC重复序列（PGRs)等。

　　2.5.3.2  PCR—双脱氧指纹图谱（ddF)  是由PCR—SSCP和双脱氧DNA测序结合产生的一种方法，主要用于结核菌耐药型测定。原理是PCR扩增产物变性形成单链，加入一种双脱氧核苷酸，通过双脱氧核苷酸末端终止法，形成一系列一端为固定末端，而另一端长度不同的单链寡核苷酸，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析末端在同一碱基的产物的序列差别。若条带出现泳动则判断为存在突变。PCR技术的广泛应用和迅猛发展，在PCR基础上建立了许多新的技术或衍生出其他体外扩增技术。本文不一一列举。

　　综上所述，结核病分子生物学的研究在不同的领域均已取得较大的进展，但分子生物学的广泛应用还受到很多限制。首先是分子生物学理论中还有许多值得进一步研究的领域，如耐药基因的研究，rpoB基因突变在耐RFP菌株中占95%左右，其他主要基因突变在耐药菌中比例均为80%作用，这就有可能还存在其他的耐药基因，这就需要我们进一步的研究，以期找到各种药物的全部或绝大部分耐药基因；其二，分子生物学技术由于技术要求高，通常仪器设备、试剂费用较高，目前，分子生物学技术大多还仅仅局限在研究实验室。随着理论研究的深入，各种技术的不断完善与发展，分子生物学定能为结核病的诊断、治疗、流行病学调查等提供更大的帮助。

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　　作者单位： 1 410013 湖南长沙，湖南省结核病防治所检验科

　　　　　　　　2 425000 湖南永州，永州市人民医院检验科

  (编辑：田  雨)