肿瘤分子遗传学研究方法进展

　　 提要 肿瘤的发生是具有其分子生物学基础的，自80年代以来许多技术相继开发应用到肿瘤的分子遗传学研究，并取得了显著的成效。这些检测DNA变异的手段按检测对象分为两类，一类主要用于基因组DNA的检测，如肿瘤原癌基因和抑癌基因的定位克降、比较基因组杂交、代表性差异分析；用于cDNA或mRNA水平的技术包括消减杂交、差异显示PCR、cDNA代表性差异分析、DNA芯片及控针微列阵等。这些技术的应用为肿瘤的分子遗传学研究开拓了一个崭新的领域。

　　 关键词 肿瘤分子遗传学；癌基因；抑癌基因

　　肿瘤是一种进行性的多基因紊乱疾病。恶性肿瘤的死亡率极高。在我国，恶性肿瘤更是各种人类疾病中的头号杀手。探清这一疾病发生的分子生物学基础无论是对肿瘤的早期诊断还是有效治疗，都将带来彻底的改观。自本世纪50年代以来，世界各国就展开了对肿瘤发生机制的探讨，在较长的一段时间内，并未取得大的进展。这与当时技术和研究手段的局限性是分不开的。70年代末，分子生物学尤其是分子遗传学的兴起为肿瘤的研究带来了新的曙光。各种分子生物学手段发明和介入使得肿瘤的研究日新月异。自80年代末期开始，人类基因组计划的实施和遗传学的进步更是大大推动了肿瘤生物学的研究，迄今，已有多种肿瘤的致病基因被相继克隆，如神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等，数个抑癌基因亦被发现和克隆，如p53,Rb,p16等。所有这些发展与许多先进技术的应用是分不开的。本文就近年来开发的在肿瘤分子遗传学研究领域的新兴技术作一扼要综述。

　　一、DNA水平的研究

　　1． 定位克隆癌基因和抑癌基因

　　利用各种DNA多态性标记对癌基因或抑癌基因进行染色体定位进而克隆该基因。定位克隆目前主要有两种策略；一是对遗传性肿瘤家系进行连锁分析，将癌基因定位于染色体某一位置再进行克隆。其二，进行染色体杂合缺失的研究，找出某种肿瘤共同缺失的片段，再克隆包含在该片段中的抑癌基因。这两者的共同之处在于首先葡萄肿瘤相关基因的染色体位置信息，再利用物理克隆的手段获得癌基因或抑癌基因。其不同在于前者主要是针对遗传性肿瘤，需要分析携带肿瘤的高发家系；后者则是针对散发性肿瘤。目前常用的DNA多态性标记是遍布基因组的各种微、小卫星DNA标记。

　　对于某种遗传病相关的基因，可通过以上标记物的连锁分析方法确定它在染色体上的位置。目前利用300-400个高度多态性的微卫星标记可以在一个高发的遗传病家系中进行全基因组的扫描，将致病基因定位于10cM以下。乳腺癌基因BRCA1就是利用连锁分析的方法定位克隆的。1990年美国的研究者利用连锁分析将乳腺癌基因定位于17号染色体上，并发现更准确的位置在遗传标记D17S579附近。通过对该区域的DNA片段进行测序后克隆了该基因[1]。

　　对于散发性肿瘤来说，人们只能得到肿瘤患者的群体样本。长期的细胞遗传学的研究证实，几乎所有的肿瘤细胞都存在染色体片段的非随机性丢失。这意味着这些丢失的片段中必然包含着某些与肿瘤相关的基因，这就是杂合性缺失（loss of heterozygosity）的概念。所谓杂合性缺失即一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现初恋或缺失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一种非常常见的DNA变异。抑癌基因的杂合性缺失会导致肿瘤的发生。利用高度多态性的微卫星DNA标记在同一病人的肿瘤组织和正常组织对某一染色体区域进行扫描，可以找到与杂合性缺失直接相关的标记，再进一步确定这些标记与抑癌基因间的遗传距离[2]。对该区域DNA片段进行候选基因突变分析或直接测序从而确定抑癌基因。在方法上一般是以PCR扩增微卫星标记的两个等位序列，之后将PCR产物变性以测序胶分析其单链。通过对比两产物单链的浓度比例即可得出这一位点是否存在杂合性缺失[3]。利用此方法，检测出在肿瘤的发生中，17p和18q存在很高的杂合性缺失频率，分别达70%和75%之多，但杂合性缺失检测DNA的突变为定点检测，即在已有的细胞遗传学信息上对某一确定的染色体区段进行检测。而对一些新的研究目标亦可用覆盖整个染色体组的微卫星标记进行全基因组扫描。

　　上述的两种方法目前一般采用96乃至394孔PCR板对标记DNA进行PCR扩增，再用自动荧光测序仪电泳分离PCR结果，速度大大高于以前的限制性片段长度多态性标记（RFLP）和Southern杂交的方法。

　　2． 较基因组杂交

　　肿瘤细胞DNA分离得到后可成功地用于检测整个基因组的DNA缺失或扩增，其中一个有效的方法是比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH）。比较基因组杂交是将肿瘤组织DNA与正常组织参照DNA同时在同一套正常染色体上作对比杂交，进而检测出肿瘤细胞DNA在染色体上发生的缺失或扩增[4]。在CGH操作中，一般是将不同来源的DNA进行酶切消化，再以生物素标记肿瘤细胞DNA，以地高辛标记正常染色体组的参照DNA，之后将等量的不同标记的肿瘤的DNA与参照DNA同时不作任何标记的正常淋巴细胞中期染色体杂交，杂交后的肿瘤组织DNA以黄颜色的FITC观测，正常参照DNA以红颜色的罗丹明观测，肿瘤组织与正常组织在染色体某一位置的杂交量与两样品在此位置的数量直接相关，并且可以通过CCD相机对杂交后的图谱进行扫描测量红黄两种颜色的对比度加以定量，若肿瘤DNA在某位置存在缺失，则该位置为红色；若有抗增，则观测到混合色即绿色。在CGH中，参加DNA是作为特定位置的变异的正常对照，因此，肿瘤细胞在整个基因组染色体水平的扩增或缺失都可以通过两种荧光染料的对比度加以确定。

　　cGH应用于肿瘤遗传学的研究，可以提供一个全基因组的“扫描图”，形象地表现出肿瘤DNA在整个染色体组的哪个特定位置存在缺失，这些部位即可能包含一些抑癌基因[5]，而哪些位置发生了扩增，而这些位置极可能存在致癌基因。至今以此方法已发现了多种肿瘤在肿瘤的某些位置存在高频率的变异，如18q的一位点发生了肺癌的抑癌基因缺失，并且现在发展了将某一类肿瘤的多个样本的DNA定量合（pool）之后以CGH分析，这样可以发现某类肿瘤在染色体水平的所具有的类同的变异，从而就有可能找到这类肿瘤发生的根本原因。

　　3． 代表性差异分析

　　在肿瘤的发生过程中，体细胞发生遗传物质丢失或重排的频率是非常高的。代表性差异（representional difference analysis,RDA）可用于检测两种不同DNA群中所存在的序列上的差异[6]。由于人类基因组DNA的复杂性，一些常规的方法并不能大量和快速地使被检DNA序列上的差异信号富集和扩大化，这就限制了这些技术的灵敏性和有限性，RDA则有效地克服了这个缺点，RDA中涉及的两套DNA分别称为检测DNA（Tester dNA）和驱动DNA（Driver dNA）。首先将两套DNA以几种内切酶作用，然后加上共同的接头（akaptor），以PCR作初步扩增。许多分子量小于1kb的片段被丰富扩增，这些扩增产物称为扩增子（amplicon），多种内切酶综合使用，即可制备覆盖全基因组的扩增子。两套不同的扩增子制备完毕后，与前边制备的驱动DNA的扩增子进行杂交，然后以杂交产物为模板，以互补于接头的序列为PCR引物进行筛选扩增。在这一步PCR扩增反应中，只有那些自身得以复性的检测DNA扩增子具有PCR引物的结合位点而被扩增，而自然复性的驱动DNA扩增子与那些两种DNA形成的异源双链DNA则不能被扩增，实际上在整个扩增过程中，驱动扩增子的竞争性结合抑制了检测扩增子的再扩增。

　　RDA用于检测肿瘤样本的DNA变异时，可以将两种DNA中的任何一种作为驱动DNA，另一种作为测试DNA。将肿瘤样本的DNA作为检测DNA，而将正常基因组的DNA作为驱动DNA，通过杂交复性，没有突变的部位都可以与正常的驱动扩增子单链复性结合而使这些部分不被扩增，而存在突变的位点只能与自身的肿瘤DNA结合复性，这样的双链肿瘤DNA被再扩增，因此得到的扩增产物极有可能即是发生了遗传突变的序列即抑癌基因，反之则可以得到癌基因。

　　二、RNA水平的研究

　　1． 消减杂交

　　消减杂交（subtractive hybridization）主要是检测肿瘤细胞与正常细胞间mRNA水平上的差异。它是80年代初期兴起的一项分子生物学技术，迄今已在分子生物学的许多领域证实了其可行性，应用于肿瘤的分子遗传学领域，消减杂交可以用于抑癌基因或致癌基因的筛选[7]。筛选抑癌基因时，正常组织cDNA以1:10的比例与肿瘤的mRNA杂交，之后去除异源双链杂交体，将剩余正常组织的单链cDAN再以1：10的比例与肿瘤的mRNA进行第二轮杂交，依此筛选，最后剩余的未能与肿瘤mRNA复性结合的单链cDNA作克隆测序分析，这些序列无法与肿瘤的mRNA互补结合，故极有可能是因为肿瘤细胞的mRNA在这些部分发生了变异，而这些变异构成了肿瘤的形成，这些序列中便可能包含有抑癌相关基因，反之，筛选致癌基因时，则以十分之一比例的肿瘤cDNA与正常组织mRNA进行筛选杂交。

　　2．差异显示PCR

　　差异显示PCR技术（differential display PCR,DD-PCR）是在1992年由Liang等人首先提出的[8]，这一技术是从mRNA水平研究不同基因组之间的差异。它的策略是将不同样本的RNA反转录后随机扩增得到许多短的表达顺序标签（express sequenced tag,EST），以测序胶检测这一系列短片段产物。对比不同样本间的PCR产物，对差异条带进行克隆，测序分析。DD-PCR的一端引物为一短的寡聚T序列，可以互补与mRNA的3’PolyA的尾巴上，一般可以在寡聚T的末端加两个锚定碱基确保有效地从mRNA的poly a的起始端开始转录以及下一步的PCR扩增。另一端的引物为一短的随机序列，理论上短的序列可以达到更好的复性结合，一般6-10个碱基长，为有得于DD-PCR的扩增，低的复性温度是必要的，一般采取40℃-42℃之间。下一步便为将感兴趣的条带从测序胶上割出，以相同的引物PCR再扩增、测序、分析。

　　DD-PCR是消减杂交的一种变换方式，用于肿瘤分子遗传学方面的研究，可以搜寻同一肿瘤的不同亚型之间，或肿瘤与癌周组织之间的差异EST，进面发现新的肿瘤相关基因。DD-PCR可以直观地在整个mRNA水平展示出肿瘤细胞在表达上所发生的各种变异。

　　3．CDNA代表性差异分析

　　由Lisitsyn等人在1993年建立的RDA技术最初是用于检测两套基因组DNA之间的差异，之后也被发展引用至mRNA的研究领域，这就是cDNA-RDA技术[9]。 cDNA-RDA综合了DD-PCR技术与基因组RDA的两方面的优势，它区别于基因组RDA的一个主要的方面是首先将mRNA反转录为cDNA之后对cDNA以内切酶消化制作代表性片段（Representation）。在操作基因组-RDA时，为使第一步产生的代表性片段不至非常复杂而难于分析，一般使用六碱基的内切酶消化基因组DNA，产生适当数量的可以PCR扩增的片段。由于cDNA无论在长度上，还是在数量上，都远远少于基因组DNA，因此可采用四碱基的内切酶消化制作更多一些的代表性片段。

　　相比于DD-PCR，cDNA-RDA具有其明显的优点，cDNA不再扩增DD-PCR中两个样本所具有的相同片段，只扩增差异片段，并且产物易于检测，琼脂糖凝胶电泳即可。与基因组RDA相比，cDNA-RDA也具有其独特的优势，第一，cDNA-RDA可以检测出任何导致特异表型的低量表达的基因，而基因组RDA仅能检测出染色体序列上所发生的变异。第二，cDNA-RNA可检测时间信赖性的瞬时表达基因，如发育过程中的基因。第三，cDNA-RNA可检测不同表型之间的差异表达基因，尽管这些序列在染色体水平上可能是相同的，因此，以cDNA-RNA研究肿瘤的突变时，我们可以直接搜寻到与肿瘤相关的表达基因。

　　4．DNA芯片与探针微列阵

　　所谓DNA芯片（DNA chips）或探针微列阵（probe microarray）技术，是指利用大规模集成电路的模式控制固相合成成千上万个寡核苷酸探针，并把它们有规律地排列在指甲大小的硅片或玻璃片上，然后，将要研究的材料如DNA、RNA或cDNA用荧光标记后在芯片上与控针杂交，再通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对每一个探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所需的信息[10]。

　　使用时，需将待检测DNA标记上专一颜色的荧光染料，如对照组用红色待检测DNA用绿色。杂交后，用激光共聚焦显微镜有相应的计算机扫描系统对荧光信号进行扫描。检测出的荧光信号图谱输入计算机进行综合处理。

　　DNA芯片在分子遗传学的研究领域中作用巨大：这包括：DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断及几乎所有的应用核酸杂交的领域[11]。

　　DNA芯片用于肿瘤生物学更是得力的武器，首先，它可以检测肿瘤组织在表达上变化的基因。将已知的cDNA或其探针按前述方法在硅片或玻璃上列阵排布，再用两种荧光进行待检测组与对照组的cDNA或其EST探针的标记。两种材料一起与芯片杂交后，每一种单独表达的基因位点就会显示单独的颜色，而两种基因组同时表达的基因位点则显示其混合色，通过颜色在亮度上的差别还可鉴定每一种基因表达的相对丰度。DNA芯片的应用在这一领域中显示出极大的优越性。Affymetrix公司的一项研究表明对每一个基因只需20个左右的探针对即可对其表达进行准确检测。而通常一块芯片可以进行10000个以上的基因的检测，斯坦福大学的Brown与NIH的Trent两个小组用通过制作在载玻片上cDNA探针的微列阵，用以比较肿瘤细胞与正常细胞在基因表达模式上的差别。准确地检测到了与肿瘤发生相关的下调和上调表达的基因。其次，在DNA水平上，DNA芯片技术可进一步与前述的比较基因组杂交（CGH）等手段结合在一起，从而大大提高上述技术的效率，除此之外，芯片技术在DNA研究的其他领域也体现出其先进性与快速的特点，如肿瘤的基因诊断，目前用于乳腺癌基因BRCA1突变检测和对乳腺癌进行诊断的DNA芯片已经开发出来并已进入市场，其检测效率可达到99%以上。

　　90年代是各种学科和技术相互渗透、交叉发展的时间，对于肿瘤的发生以及治疗这一医学界与科研领域的难关，人们开始以一个全局观念去思考，可以相信在不久的将来，这些以多门学科、多项技术相互融合产生的工具和手段将对揭示肿瘤发生的根本机理起到不可估量的作用，肿瘤的根本治疗也将基于其发生机理的清晰而成为现实。

　　参考文献

　　1 Bowcock AM et al,Am J Hum genet,1993;52(4)：718

　　2 abujiang P et al.Oncogene.1998;17(23):3029

　　3 koufos A et al.Nature,1985;316(6026):330

　　4 kailioniemi A et al.Science,1992;258(5083)818

　　5 balsara BR et al.Cancer Res,1999;59(2):450

　　6 kallioniemi A et al,Science,1992;258:818

　　7 lisitsyn N et al,Science,1993;259(5097):946

　　8 liang P et al,Science,1992;257(5072):967

　　9 hubank M et al,Nucleic Acids Res,1994;22(25):5640

　　10 abbott A,Nature,1996;379(6564):392

　　11 cole KA et al,Nat Genet,1999;21(1 Supp1):38