活性氧和细胞凋亡

发布：www.liulingling.com　来源：医学杂志

　　进入九十年代以来，越来越多的肿瘤、发育和神经生物学家、免疫学家和其他生物学工作者以极大的热情致力于细胞凋亡(apoptosis)或称细胞程序化死亡的研究，使之成为当今生命科学研究中最引人注目的领域之一。许多研究显示活性氧(reactiveosygenspecies,ROS)，即氧自由基及其衍生物与细胞凋亡密切相关。例如，低浓度的H2O2能诱导某些类型的细胞(如血管内皮细胞、HL60细胞)凋亡，氧化的低密度脂蛋白可诱导淋巴细胞凋亡，过氧亚硝基自由基可诱导胸腺细胞凋亡，等。本文拟就ROS和细胞凋亡的关系作进一步综述。

　　1 ROS和凋亡细胞的线粒体功能变化的关系

　　细胞游离系统(cell－freesystem)为认识细胞凋亡机制提供了良好的模型。该系统通过分离细胞核和细胞浆，制备去核细胞(cytoplast)和无浆细胞，可以独立分析细胞浆和细胞核在细胞凋亡中的作用。以此为基础的两大发现强力地揭示线粒体在细胞凋亡中的重要性：①细胞自发的受Bcl-2抑制的核固缩和DNA裂解依赖线粒体的存在；②caspase的活化依赖细胞色素C自线粒体释放。随后的研究显示各种因素诱导的细胞凋亡均出现线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位(△ψm)的破坏。业已清楚，造成△ψm下降的主要原因是线粒体膜通透性转运孔(MPT)的开放。MPT位于线粒体内、外膜之间，由一组蛋白复合体构成。许多因素可影响MPT的开关。其中，定位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白(ANT)发挥重要作用。ANT分子的构象改变，尤其是其相邻巯基的氧化还原状态明显影响MPT的开关。当相邻巯基氧化为二硫键或类似于二硫键的交联复合物时，MPT开放。反之，MPT关闭〔1〕。因此，MPT的开放及△ψm的破坏与细胞的氧化还原状态，如巯基氧化、细胞GSH缺少和ROS的堆积密切相关。Macho等〔2〕在研究胸腺细胞凋亡机制中发现，早期凋亡细胞胞内GSH下降和ROS含量轻度升高。后者进一步引起NADH和NADPH下降，产生大量超氧阴离子自由基。因此，在凋亡过程中，ROS既是促发和加速MPT开放重要效应分子，又是MPT开放的产物。这种正反馈机制使MPT开放具有自我放大效应和“全”或“无”的特点，使线粒体△ψm的下降进入不可逆过程，细胞发生凋亡。

　　2 ROS和凋亡信号传导分子Ca2＋的关系

　　自从Kaiser等发现糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与Ca2＋离子内流增加有关以来，越来越多的直接或间接证据表明胞浆Ca2＋浓度上升是细胞凋亡的一个重要事件。Ca2＋作为第二信使或死亡信号传导分子，通过参与某些和细胞凋亡相关的蛋白激酶和核酸酶的活化介导细胞凋亡。实际上，在细胞凋亡过程中胞内Ca2＋浓度上升和ROS的产生、堆积之间也存在密切联系，而且后者往往先于胞内Ca2＋浓度的上升。例如，Tan等〔3〕发现神经细胞系HT22凋亡过程中，ROS的大量产生先于胞内Ca2＋浓度的持续上升。进一步地，ROS的产生被FCCP(一种能够抑制线粒体呼吸链产生ROS的芳香族化合物)阻断后，胞内Ca2＋水平升高不明显。反之，当Ca2＋的内流被钴阻断时，胞内ROS的产生和堆积也受到抑制。因此，他们认为在凋亡早期贮存于内质网或线粒体的Ca2＋释放引起胞内Ca2＋水平轻度升高，并协同其它因素(如GSH的下降等)引发线粒体大量产生ROS，而ROS进一步促进胞内Ca2＋浓度持续升高。David〔4〕等发现抗氧化剂和MPT抑制剂能够抑制糖皮质激素诱导的胸腺细胞内Ca2＋水平的升高，进而抑制凋亡。他们认为凋亡中产生的ROS可能引起细胞内贮存Ca2＋的细胞器如内质网、线粒体膜和胞膜的破坏，导致胞内Ca2＋重分布和胞外Ca2＋的内流，从而引起细胞内持续的Ca2＋水平升高。总之，ROS的产生堆积和Ca2＋水平的升高都是细胞凋亡中的重要事件，且两者相互促进，在细胞凋亡中发挥重要作用。

　　3 ROS与调亡调控蛋白Bcl-2关系

　　Bcl-2基因所编码的蛋白质属于胞内膜整合蛋白。它对大多数因素诱导的细胞凋亡具有负性调节作用。Bcl-2家族则包括诱导凋亡和抑制凋亡两大亚家族。前者如Bax、Bcl-xs、Bik、Bak等，后者除Bcl-2外，还有Bcl-XL、Ced-9等。Bcl-2家族成员大多数由C端跨膜结构域(TM)和1－4个BH(Bcl-2Homology)结构域构成。近来在对Bcl-2作用机制研究中发现Bcl-2抑制细胞凋亡作用可能涉及Bcl-2对凋亡过程中ROS产生的影响。Hochman〔5〕等发现敲除Bcl-2基因的小鼠神经细胞内氧化蛋白含量明显升高，而且对各种氧应激特别敏，表明失去Bcl-2导致细胞氧化损伤增加和抗氧化能力的下降。Kane〔6〕等发现表达Bcl-2的GT1－7神经细胞在去除GSH时，胞膜脂质过氧化等氧化损伤无明显增加，而且胞内ROS水平也无明显升高。Hochman等认为Bcl-2蛋白是一种ROS清除剂，能有效清除超氧阴离子等氧自由基，抑制过氧化物产生及ROS对细胞的损伤。同时，Bcl-2蛋白能够调节并维持细胞内抗氧化剂的活性，并根据Bcl-2蛋白主要位于细胞内ROS产生的部位，如线粒体膜，内质网膜，核膜等，推测Bcl-2蛋白能够调节细胞尤其是线粒体内ROS的产生。此外，Bcl-2蛋白可能阻断ROS对线粒体膜通诱性的影响及由于膜通透性下降引起的细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等释放。但是，Satho等〔7〕发现在PC12细胞，Bcl-2并不能降低氧应激引起的ROS产生，但能阻止线粒体△ψm的下降。Motyl等〔8〕报道TGF-β1诱导小鼠淋巴细胞性白血病细胞系L1210胞内Bcl-2水平下降和胞内ROS水平升高，且出现于TGF-β1加入后24～48小时，但在此之前胞内已有一次ROS含量的增加。显然，第一次ROS升高与Bcl-2下降无关。综上所述，Bcl-2作为凋亡负性调控基因，可能并不能抑制凋亡诱导因子引起的细胞内初次ROS的产生，但Bcl-2能够阻断第二次大量ROS的产生(主要是由线粒体功能改变引起的ROS产生)。

　　4 ROS与FAS/FAS配体、TNFα及其它细胞毒性分子诱导凋亡的关系

　　FAS/APO-1(CD95)是一种Ⅰ型跨膜受体蛋白，由胞外结合区、跨膜区、及胞内区域构成，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家庭。FAS通过与其拮抗剂和天然配体(FASL)相互结合，引起FADD，Caspases等一系列复合物、酶的链级活化，最终诱导细胞凋亡。近来研究发现，在FAS/FAS配体(FASL)诱导的细胞凋亡过程中，FAS和FASL交联能够引起细胞内ROS含量增加和细胞氧化还原状态的改变。Suzuki等〔9〕用化学荧光指示剂Chemluminescence(该指示剂能与包括O－2、OH·、单线氧等各种ROS反应)观察B淋巴瘤细胞株BJAB和Ramos以及T淋巴细胞性白血病细胞株Jurkat在FAS/FASL交联后胞内ROS含量变化，发现FAS/FASL交联引起细胞内迅速和特异性ROS的产生，而且这此细胞内ROS产生过程基本相同。ROS大都在FAS/FASL交联后20秒内产生，5分钟后达到高峰，然后缓慢下降，但ROS水平升高至少维持40分钟，而FAS引起的ROS增加可被DPⅠ(dipenylene iodonium chloride,NADPH氧化酶抑制剂)所抑制，提示FAS介导的ROS增加可能主要通过NADPH氧化酶系统产生。当FAS/FASL交联引起的胞内ROS产生被各种抗氧化剂(如GSH、NAC、疏基还原剂等)所阻断时，FAS介导的细胞凋亡也被抑制，如提高外周活化T细胞内GSH含量，能够降低T细胞对FAS介导凋亡的敏感性。有研究表明H2O2能够激活蛋白酪氨酸激酶(PTK)，而PTK的活化是FAS介导细胞凋亡必要步骤，可以推测，FAS/FASL交联后引起胞内产生的ROS激活PTK，然后在PTK作用下促发一系列凋亡链级反应。因此，ROS不仅是FAS/FASL交联后的产物，而且在FAS/FASL诱导的细胞凋亡中发挥了重要作用。

　　ROS在α-TNF诱导的细胞凋亡中也起着重要的介导作用。Gotoh等〔10〕发现α-TNF作用于“293”细胞，引起胞内凋亡信号调控激酶1(ASK1)的活化和细胞凋亡。ASK1的激活可被抗氧化剂所阻断，而过氧化氢可导致ASK1的活化。作者认为α-TNF诱导的凋亡中ASK1活化是通过ROS介导的。具体地，ROS可能通过促使ASK1形成二聚体而激活ASK1。但是，Sidoti〔11〕等认为α-TNF诱导Hala细胞凋亡至少存在二条独立的凋亡途径，其中一条途径需要ROS参与，而另一途径则无需ROS的介导。

　　细菌生物碱staurosporine能够诱导包括神经细胞在内的许多细胞发生凋亡。Kruman〔12〕等在研究staurosporine诱导PC12细胞凋亡机制中发现，staurosporine作用于细胞，首先引起胞内Ca2＋水平的上升和线粒体产生ROS增多和堆积，然后出现胞膜脂质过氧化，线粒体△ψm下降，以及细胞核凋亡特征性的改变，而Ca2＋的鏊合剂BAPTA和ROS清除剂尿酸均能抑制staurosporine诱导的细胞凋亡，提示胞内Ca2＋水平的上升和ROS的堆积是staurosporine诱导细胞凋亡所必须的。近来，Ahlemeyer〔13〕等发现雏鸡胚胎神经细胞经staurosporine处理后4小时，细胞内ROS水平增高4倍，60％细胞凋亡，而在加入10mmol全反式维甲酸(RA)后，同样经staurosporine处理，细胞内ROS增高幅度降至2倍，而凋亡细胞也降至38％，这可能是RA抑制胞内ROS产生和堆积有关。

　　最近，Rollet-Labelle〔14〕等发现黄嘌呤氧化酶(XO)和葡萄糖氧化酶(GO)作用于中性粒细胞，引起细胞内H2O2及OH。含量增加，加速细胞凋亡。这种效应可被OH。鏊合剂HBED所抑制，提示OH。可能是中性粒细胞凋亡的介导因子。此外，Lee等〔15〕发现KIT(一种酪氨酸激酶受体，属于血小板生长因子受体家族)通过阻止小鼠DP16Friend红白血病细胞株内ROS的产生而抑制p53诱导的凋亡。ROS诱导或介导的T细胞凋亡也参与HIV病毒感染患者的T淋巴细胞减少〔16〕。

　　5 ROS和药物诱导细胞凋亡的关系

　　随着对细胞凋亡机制研究深入，具有凋亡诱导作用的药物不断被发现。ROS在这些药物诱导的细胞凋亡中可能发挥了重要作用。首先，ROS在多种抗肿瘤药物诱导凋亡过程中起着介导和调节作用，例如，化疗药物去甲氧柔红霉素(doxorubicin)诱导白血病和神经母细胞瘤凋亡与肿瘤细胞内ROS的产生密切相关，而抗氧化剂(如谷胱甘肽等)阻断细胞内ROS的产生，并明显抑制去甲氧柔红霉素诱导的肿瘤细胞凋亡，相应地，对该药不敏感的肿瘤细胞有较高的胞内GSH水平，降低这些细胞内GSH含量可使胞内ROS大量产生并可恢复耐药肿瘤细胞对去甲氧柔红霉素的敏感性〔17〕。无独有偶，三氧化二砷(As2O3)诱导肿瘤细胞凋亡过程中，细胞内ROS的产生一旦被阻断则As2O3诱导的细胞凋亡也明显受抑，而且对As2O3敏感的肿瘤细胞内GSH含量明显低于对As2O3耐药的肿瘤细胞，说明ROS的产生可能是As2O3诱导肿瘤细胞凋亡所必须的〔18〕。此外，ROS的产生在一些抗肿瘤新药(如新合成的维甲类药物4羟苯维甲胺、雌激素受体拮抗剂ZM1832780，阿霉素类衍生物和治疗前列腺癌新药BMD188)诱导凋亡发挥了重要作用，降低肿瘤细胞内拮抗ROS产生的抗氧化剂水平以促进胞内ROS的大量产生可能是提高这些药物诱导肿瘤细胞凋亡效率的有效方法之一〔19～22〕。近来研究发现非甾体类抗炎药(NSAIDS)能通过加速转化细胞的凋亡而有效抑制直肠癌进展，在对NSAIDS类药物(消炎痛、水杨酸)诱导HT29细胞(人类直肠癌细胞株)凋亡机制中发现：NSAIDS类药物能增加HT29细胞内过氧化物(ROS)含量，从而加速肿瘤细胞凋亡，并认为NSAIDS类药物改变肿瘤细胞内ROS代谢的能力与其抗肿瘤效应密切相关〔23〕。不仅抗肿瘤药物诱导凋亡与ROS有关，而且其它一些抗炎药物作用也与ROS相关，如近来发现Bucillamine(BUC)，一种治疗类风湿关节炎(RA)药物是通过促进RA患者关节腔滑液细胞的凋亡、抑制滑液细胞过度增殖从而治疗RA，而BUC的诱发滑液细胞凋亡作用依赖于其促进胞内ROS产生，一旦ROS产生被阻断，其促凋亡及治疗作用亦被终止〔24〕。

　　作者单位：上海第二医科大学附属瑞金医院，上海血液学研究所(上海，200025)

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