细胞凋亡与胰腺炎

　　摘要 从细胞凋亡的分子机制来分析细胞凋亡与胰腺炎之间的关系，并简要综述实验性胰腺炎的凋亡诱导治疗。

　　关键词：细胞凋亡 胰腺炎 治疗

　　近年的研究证实细胞凋亡参与胰腺炎的病理生理过程，但要从本质上阐明细胞凋亡与胰腺炎之间的关系应从细胞凋亡的分子机制来进行研究。现在认为细胞调亡参与胰腺炎发病主要有两种机制：一类是受基因调控；另一类则是非基因调控。

　　1基因调控

　　受基因调控的细胞调亡又称为程序性细胞死亡。一般分为两类：一类是直接调控，如癌基因；另一类则是间接调控。如生物活性分子，通过诱导癌基因的表达发挥调控作用。

　　癌基因中bc1-2基因家族是最受关注的与细胞凋亡相关的基因之一。Wada等[1]对胰管结扎（PDL）鼠应用抗bc1-2单克隆抗体和抗增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体以免疫印迹和免疫组化方法对bc1-2和PCNA进行检测。结果显示，PDL鼠胰腺导管上皮细胞的bc1-2表达在第四、五天高于对照组2~5倍。bc1-2和PCNA免疫染色在对照组的胰腺导管上皮为微弱的染色，而在PDL鼠胰腺导管皮bcl-2和PCNA免疫染色阳性细胞数量增加，分别在第二天和第三天达最高值。该结果表明，bc1-2具有抑制胰腺导管上皮细胞凋亡的功能。为进一步研究bc1-2基因家族中各基因的作用，Miyamoto等[2]研究PDL和雨蛙肽诱导急性胰腺炎两种鼠实验模型和人慢性阻塞性胰腺炎（COP）胰腺外分泌细胞bc1-2家族相关基因的表达。结果显示，在正常胰腺未见bc1-2基因家族表达；在PDL组胰管结扎后1天在胰腺细胞即观察到bax和bc1-x表达，且在第二、三天尤为显著，而其时胰腺腺细胞也发生凋亡。同时导管细胞增加形成导管管状复合体，导管细胞内bc1-2、bc1-x染色增加并在第五天达最大值。鼠急性胰腺炎模型首次注射雨蛙肽后8小时和48小时发现胰腺细胞凋亡，同时应用免疫组化方法观察到胰腺细胞中存在 bax和bc1-x表达。COP时导管管状复合体导管细胞bc1-2、bc1-x、mc1-1染色阳性，但bax染色阴性。上述结果表明，在两种鼠胰腺炎模型中胰腺细胞内bax诱导细胞调亡；而bc1-2、mc1-1可能在防止导管细胞凋亡和形成导管管状复合体中起作用；bc1-x有既可诱导又可抑制细胞凋亡的双重作用。虽然许多实验证明bc1-2基因家族在胰腺细胞凋亡中发挥重要作用，但其作用机制尚未完全阐明。

　　癌基因中另一个与细胞凋亡相关的基因是被称为“基因组卫士”的野生型p53。Maacke等[3]在行ERCP时收集了27例慢性胰腺炎病人胰液细胞学标本，并应用一系列p53特异性单抗PAb1620、PAb1801、PAb240及CM-1（人重组p53多克降抗血清）以免疫过氧化酶染色观察p53表达情况，同时以TUNEL法检测调亡细胞。结果示，27例慢性胰腺炎病人中有16例（59%）p53蛋白表达阳性，11例PAb1620表达阳性，同时发现有凋亡细胞。可能的机制是慢性胰腺炎时氧自由基和一氧化氮基团损伤DNA。p53表达增加可能是DNA损伤的结果，并在DNA损伤的基础上诱导细胞调亡。有人认为野生型p53提高细胞内bax蛋白表达使得bc1-2/bax比例失衡而促进细胞凋亡[4]。

　　在基因调控与细胞凋亡关系的研究中，另一热点课题是一些间接调控细胞凋亡的生物活性分子，如转化生长因子（TGF）β、肿瘤坏死因子（TNF）等。最近，Subramanian等[5]从源于人中胚层的成骨细胞中识别一种TGF-β调控的锌指编码基因的TIEG（TGF-β诱导的早期基因）与胰腺炎细胞凋亡有关。为进一步研究TGF-β在胰腺外分泌细胞群中的表达、功能及其调控机制，Tachibana等[6]对培养的鼠胰腺AR42J细胞和人五种胰腺外分泌细胞PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、HST66T和Capan1进行免疫印迹分析，结果发现，在这六种外分泌细胞中均有丰富的TIEG mRNA表达。应用纯化的TIEG亲和抗体进行定位检查发现TIEG存在于正常人胰腺外分泌部导管和腺细胞群。研究还发现，经TGF-β处理上述细胞2小时后可见TIEG表达上调。为进一步观察TIEG的表达增加是否诱导胰腺外分泌细胞凋亡，用5ng/ml tGF-β1处理PANC1细胞24小时、48小时和72小时，结果显示，在任一时间点TGF-β1都增加凋亡率，尤以72小时后为最甚。为进一步证实TIEG表达具有增加诱导凋亡功能，还进行了转染实验。用10μg表达TIEG载体（pMEX-neo-TIEG）转染PANC1细胞和仅转染对照载体（pMEX-neo）的PANC1细胞及未转染细胞进行研究。MTS增殖分析结果示，未转染细胞和pMEX-neo细胞生长正常；pMEX-neo-TIEG细胞增殖停止，而且72小时后pMEX-neo-TIEG细胞量较实验初低。DNA梯形图谱分析表明，pMEX-neo-TIEG细胞凋亡数在任一时刻均超过30%，而且还发现pMEX-neo-TIEG细胞凋亡率比TGF-β1处理的PANC1细胞凋亡率高，这可能是观察到的TGF-β1处理的PANC1细胞TIEG上调是瞬时的，而pMEX-neo-TIEG细胞内的TIEG上调则是稳定的。因此，TGF-β诱导的TIEG表达增加可诱导细胞凋亡。

　　还有一些资料表明，TNF是介导细胞凋亡的介质[7]，可能的机制是TNF激活T细胞表达Fas配体，Fas配体再与靶细胞结合促使靶细胞凋亡。

　　不仅TGF-β、TNF这些因子通过诱导癌基因表达发挥调控作用，而且一些生物活性物质也有类似的机制。有学者报道，用维生素K3和超过生理浓度的雨蛙肽（＞10-10M）[8]和用低浓度peroxynitrite（2~5μM）[9]分别培养鼠胰腺AR42J细胞，结果均可观察到细胞凋亡现象，且发现野生型p53表达增加。上述结果表明，一些生物活性物质可能通过野生型p53表达增加诱导细胞凋亡。

　　2非基因调控

　　近年来，尽管有关蛋白质和RNA合成抑制剂抑制凋亡研究已证实蛋白质大分子合成是凋亡的另一重要生化特征，同时证实细胞凋亡是一种由内在基因编码调控的细胞死亡方式[10]。但也有Fas介导细胞凋亡不依赖蛋白质合成的报道[11]。一些损伤因子直接或间接损伤DNA而致细胞凋亡，如缺血再灌注等。这些现象表明凋亡除受基因调控外还受非基因调控。

　　Fujimoto等[12]用血管钳钳夹鼠胰腺下方的脾动脉1小时后再松开血管钳造成选择性胰尾部缺血再灌注的实验模型，然后用DNA凝胶电泳方法观察细胞凋亡情况，结果在缺血再灌注后48小时观察到胰腺细胞凋亡的典型DNA梯形图谱。该实验表明，缺血再灌注可诱导胰腺细胞凋亡，但其机制尚不太清楚。

　　尽管从凋亡的分子机制研究凋亡与胰腺炎关系取得了一些进展，但仍需进一步阐明凋亡在胰腺炎中的确切作用机制，从而使之应用于临床实践。

　　新近，Matsuzaki等[13]研究发现，在雨蛙肽诱导的急性胰腺炎的急性阶段很少观察到细胞凋亡，但在急性期后恢复阶段则见大量细胞凋亡。而Tanaka等[14]研究观察到，在不同的慢性胰腺炎实验模型中显示凋亡的显著性。这些结果表明，细胞凋亡可能是胰腺炎病理生理中的一个环节，可能使胰腺炎向好的方向发展，亦可能使病情恶化。

　　3实验性胰腺炎的凋亡诱导治疗

　　Kaiser等[15]报道，在五种急性胰腺炎模型中急性胰腺炎严重程度与凋亡呈负相关现象，即在阻塞鼠胆胰共同通路和输注大剂量雨蛙肽诱导的轻度胰腺炎中可观察到细胞凋亡，而在阻塞负鼠胆胰共同通路和年幼雌鼠CDE饮食（无胆碱而乙硫氨酸充足的食物）诱导的重症胰腺炎则观察到坏死。凋亡与胰腺炎严重程度呈负相关，表明细胞凋亡可能是对胰腺损伤的有利反应。最近有研究提出，诱导细胞凋亡可减轻胰腺炎的严重程度。Saluja等[16]报道，在细胞凋亡存在条件下可减轻雨蛙肽诱导的胰腺炎严重程度。给予实验鼠5周大豆饮食后转为正常饮食27小时，然后重复注射超大剂量雨蛙肽50μg·kg-1·h-1共12小时诱导胰腺炎，对照组给予5周正常饮食后注射同样剂量的雨蛙肽诱导胰腺炎。结果发现，在5周大豆饮食继而转为正常饮食后，原来肥大的胰腺腺体迅速缩小，并且观察到缩小期间伴有大量的腺细胞凋亡，在缩小期间注射雨蛙肽诱导的胰腺炎炎症程度为2+，而对照组炎症为4+（4+表示广泛的炎症，0表达无炎症）。结果表明，在腺细胞凋亡时注射雨蛙肽，可减轻其诱导的胰腺炎严重程度。为进一步证实上述结果，Kaiser等[10]在结扎鼠胆胰共同通路诱导胰腺炎后给予蛋白质合成抑制剂环已酰亚胺以抑制细胞凋亡，结果发现抑制细胞凋亡后加重胰腺炎病变程度。另外一些学者用实验证明DA-9601[17]和1-cyano-2-hydroxy-3-butene(CHB)[18]诱导细胞凋亡也减轻了雨蛙肽诱导的胰腺炎严重程度。

　　由此可见，诱导调亡可能会降低胰腺炎的严重程度。尽管这些研究仅限于动物实验水平，但仍显示出细胞凋亡用于胰腺炎临床实践的美好前景。相信随着细胞凋亡的继续深入研究，必将有助于揭示胰腺炎的发病机制，并有可能提高胰腺炎的诊疗水平。

　　参考文献

　　1 wada M et al. Gastroenterology,1996;110(4 Suppl):A440

　　2 miyamoto Y et al. Gastroenterology,1997;112(4 Supp1):A464

　　3 maacke H et al. Br J Cancer,1997;75:1501～1504

　　4 burger M et al. Int J Cancer,1995;60:590

　　5 subramanian M et al. Nucleic Acids Res,1995;23:4907～4912

　　6 tachibana I et al. J Clin Invest,1997;99:2365～2374

　　7 norman J et al. Gastroenterology,1997;112(4 Supp1):A468

　　8 sata N et al. Gastroenterology,1996;110(4 Supp1):A428

　　9 sata N et al. Gastroenterology,1996;110(4 Supp1):A479

　　10 kaiser A et al. Am J Physiol,1996;271(3 Pt1):C982～C993

　　11 anderson M et al. J Immunol,1996;156:4083～4091

　　12 fujimoto K et al. Digestion,1996;57:228

　　13 matsuzaki S et al. Gastroenterology,1996;110(4 Supp1):A416

　　14 tanaka T et al. Gastroenterology,1997;112(4 Supp1):A487

　　15 kaiser A et al. Am J Physiol,1995;269(5 Ptl):C1295～C1304

　　16 saluja A et al. Biochem Biophs Res Commun,1996;220:875～878

　　17 halm K et al. Gastroenterology,1997;112(4 Supp1):A447

　　18 bhatia M et al. Gastroenterology,1997;112(4 Supp1):A428