造血细胞体外扩增的研究进展

　　摘要 造血细胞体外扩增是一项具有广泛应用前景的新技术，而造血干/祖细胞纯化方法和细胞因子作用机理，以及造血细胞对细胞因子的反应性是体外扩增研究的重要方面，近年的研究已日趋深入。本文综述上述方面的研究进展。

　　造血细胞体外扩增是近年发展起来的新技术，由于其具有广泛的临床应用前景，因而受到广泛关注。配伍使用多种细胞因子或持续灌注培养的造血细胞体外扩增已取得一定经验和成果，然而还有许多悬而未决和有争议的问题，有待进一步深入研究。本文综述有关方面的最新研究进展。

　　1 分选用于体外扩增的造血祖细胞的新方法

　　体外扩增造血细胞多以分选的造血干/祖细胞作为扩增的细胞基础。如果用于分选的细胞标志不恰当，则分选过程本身即造成造血干细胞的丢失，进而也可导致体外扩增后造血细胞移植的失败，因此选择理想的分选造血干/祖细胞的标志是体外扩增造血细胞的一个关键问题，值得进一步深入研究。

　　cD34作为选择造血干/祖细胞的标志是近年来最广泛被采用的方法，而且无论人或动物的造血细胞均可以此方法加以分选。但最近有学者对CD34阳性与造血干细胞的关系提出了质疑[1~4]。

　　1996年，Osawa等[1]通过一系列实验研究首先提出，成年小鼠骨髓造血干细胞位于CD34低表达或阴性组分（CD341o/-），输入单个小鼠CD341o/-、c-Kit+、Sca-1+及系标志阴性（Lin-）细胞可使21%的受者获得长期淋巴造血系统重建。而小鼠的CD34+c-Kit+Sca-1+Lin-造血细胞则显示早期但不能维持的多系造血重建，提示这些细胞为具有多系分化功能而缺乏自我更新的造血祖细胞。

　　以后的实验进一步证实了CD34-造血干细胞的存在。用荧光DNA结合染料Hoechst33342染色小鼠的骨髓细胞，然后用双波长流式细胞仪的方法，可分离出能够重建致死量照射受体小鼠造血功能的骨髓干细胞，它们是一类体积很小且均一的细胞群体，且为CD34-Lin-细胞。用同样的方法对人类、罗猴和猪骨髓细胞的研究也表明存在迄今尚未被认识的、缺乏CD34表面标志的造血干细胞群体[2]。另有报道提出表型为Thy-1lowLin-/lowSca-1+(TLS)的小鼠造血干/祖细胞中有15%为CD34-细胞。体外克隆分析和对经致死量照射小鼠的造血重建研究显示，TLS中大约95%的CFSs、CFU-S、CAFCs是CD34+细胞，而更早期的长期重建造血细胞则同等分布于CD34+和CD34-的TLS细胞[3]。

　　同时用Hoechst33342和派若宁Y作DNA和RNA染色可用以分离人骨髓属于G0期的CD34+细胞（G0CD34+）[5]。与属于G1期的CD34+细胞相比，G0CD34+细胞具有对细胞因子刺激反应延迟和富含长期培养起始细胞的特征。对G0CD34+细胞的激活动力学分析发现，这些造血干细胞的造血能力和对细胞因子刺激反应方面仍存在相对的差异。在体外用SCF、flt3配体或ⅠL-3单独刺激培养7天后，以克隆增生分析细胞的增殖能力和维持克隆形成细胞前体（pre-CFC）的能力，表明一些细胞的功能状态仍处于静止期，而另一些细胞则已完成连续的分裂周期。这些结果提示细胞对不同刺激的分裂反应和维持造血功能之间的关系值得进一步深入研究。

　　由于CD34+造血细胞仍是一个异质性的细胞群体，在这个群体中如何进一步纯化造血干细胞以提高造血细胞体外扩增的效果也有较多的研究报告。在用Hoechst33342（Hst）分离静止期细胞的同时，用Rhodamine123(Rh123)分离代谢不活跃的细胞，两者结合在CD34+细胞中进一步纯化出CD34+HstdimRh123dim(CD34+d/d)和CD34+HstbrightRh123bright(CD34+b/b)细胞。对这些在有丝分裂和代谢功能上均一的CD34+造血细胞的细胞周期状态、前体细胞含量、维持体外造血的能力和LTC-IC含量分析表明，Hst和Rh123染色结合CD34免疫荧光检测可分离人造血干/祖细胞中静止的亚群，即CD34+d/d细胞，它们具有与干细胞相关的功能特性，提示可作为用于体外扩增及体细胞基因治疗的造血干细胞的理想选择[6]。单独用Rh123染色也可在CD34+造血细胞中进一步富集人造血干细胞[7，8]。

　　最近提出了一种新的造血干/祖细胞的表面标志，AC133，它可与一种新的杂交瘤细胞系所产生的抗干细胞糖蛋白抗原的单克隆IgG抗体（分子量为120kD）发生特异性结合反应。AC133抗原选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中CD34+造血干/祖细胞表面，因此AC133可替代CD34而作为选择用于扩增和移植的造血干/祖细胞的标志[9]。

　　2 对细胞因子在造血细胞体外扩增中作用的深入探讨

　　如前所述，造血细胞体外扩增方法还需要多方面的改进，但刺激造血的细胞因子的存在仍是最基本的条件，因此深入研究促进早期造血细胞自我更新和高度增殖的细胞因子及其作用规律，并进一步研究和克隆新的刺激造血的细胞因子，不仅可进一步提高造血细胞体外扩增应用的临床效果，还有利于研究细胞内调节途径和促进基因治疗的发展。

　　在已有的造血刺激因子中，目前认为对体外扩增早期造血细胞最有效的是Flt3配体和TPO[10]，而且两者合用时伴有较少的细胞分化[11]。在无血清的液体培养体系中，研究16种细胞因子对CD34+CD38-细胞的体外扩增作用结果显示[11]，Flt3配体和SCF、IL-3合用培养10天，可使LTC-IC扩增大约30倍；而当单独使用每种细胞因子时，则仅有Flt3和TPO可刺激LTC-IC的扩增，但由TPO诱导扩增的LTC-IC中进一步分化产生的克隆形成细胞（CFC）却是红系细胞，其机理尚不清楚。单独对CFC作用最强的是IL-3，而并不是Flt3配体。

　　有作者在含有IL-3、IL-6和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的液体培养体系中，比较Flt3配体和SCF对CD34+细胞作用的差别[12]。结果显示，在培养21~28天时，含Flt3配体的培养可产生更多数量的造血祖细胞，且当加用微血管内皮细胞作为支持基质时，含Flt3配体体系的扩增作用进一步增强，证实Flt3配体结合其他造血刺激因子可有效扩增造血祖细胞，并有利于保存和可能扩增能够长期产生造血祖细胞的造血干细胞。Flt3配体与SCF、IL-3伍用在一个大规模的搅拌悬浮培养中可使脐血CD34+细胞的LTC-IC扩增8±3倍，CFC扩增45±36倍[13]。

　　在多种刺激因子存在的混合培养体系中，用变量的多参数分析方法确定其中每种细胞因子所起作用的重要性是最近报道的方法[14]。用此方法在SCF、IL-3和IL-6存在的基本体系中，分析Flt3配体、巨核细胞生长和发育因子（Megakaryocyte growth and development factor,MGDF）、EPO和G-CSF对不同细胞群扩增的调节作用，认为EPO、G-CSF和Flt3配体对晚期祖细胞群有明显的刺激作用，其中Flt3配体和EPO对CD34+细胞的扩增也起很关键的作用，而MGDF和Flt3配体对BFU-E扩增最重要，同时Flt3配体对CFU-GM的扩增也有很强的作用。在所分析的细胞因子中没有发现对巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）有明显刺激作用的因子。此外，研究还显示Flt3配体和MGDF对获得高水平的LTC-IC扩增是必需的，即体外扩增早期造血干/祖细胞需要这两种细胞因子的参与。

　　3 不同来源的造血细胞体外扩增能力的异质性

　　文献报告的造血细胞体外扩增研究结果常存在较大的差异。即使是在同样的细胞因子组合使用条件下，细胞的扩增能力和移植能力方面仍有很大差别。出现此种现象的原因除培养条件等因素外，所培养造血干/祖细胞的来源不同可能也是其重要原因之一。从人胎肝、脐血和成人骨髓分离CD34+CD38-和CD34+CD38+造血祖细胞亚群，并对其生长特性、细胞因子需要及对细胞因子的效应作比较分析[15]的结果发现：①成人骨髓CD34+细胞中CD38-细胞的比例明显低于胎肝和脐血；②成人骨髓中CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞亚群之间在功能上的差别明显大于胎肝和脐血；③这些造血祖细胞对细胞因子的效应和它们在个体发生学上有年龄之间存在负相关关系，而对细胞因子的需要与个体的年龄之间则为正相关关系；④在经典的半固体培养体系中，只有在发生学上最早的细胞即胎肝细胞可自发产生克隆，脐血和成人骨髓均不能见到；⑤干扰素-γ（IFN-γ）和巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)对这些细胞调节作用的程度也取决于不同来源祖细胞在个体发生上的年龄差异：IFN-γ仅选择性地抑制成人骨髓的CD34+CD38-细胞亚群，但可同等程度地抑制胎肝和脐血的CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞；对成人骨髓有作用的MIP-α，对胎肝和脐血造血祖细胞却不存在任何刺激或抑制的作用。上述结果证实胎肝、脐血和成人骨髓的造血干/祖细胞之间在功能和生物学特性上存在重要的差异，提示我们在进行造血细胞体外扩增时要充分考虑细胞来源的因素，且进一步明确它们之间的差别，对有目的地进行体外扩增、确定干细胞移植策略及成功地进行基因转染均有重要的意义。

　　对人骨髓、脐血和外周血CD34+细胞在适当的细胞因子刺激条件下的体外扩增能力进行研究的结果表明，不同来源的CD34+细胞均可获得明显的体外扩增[16]，但也有报道认为经动员后的外周血CD34+细胞中虽含有较骨髓更多的LTC-IC，但其体外扩增能力很有限[17]。所用的动员方案是给予肿瘤患者大剂量环磷酰胺后再给予G-CSF、GM-CSF、IL-3、PIXY321其中一种，或者这些因子合用作为动员剂。经测定动员后的外周血CD34+细胞在体外扩增后产生祖细胞、CD34+细胞和LTC-IC的能力，并与骨髓和脐血CD34+细胞在同样下扩增后的细胞相比较，结果表明，虽然形成克隆的祖细胞数和CD34+细胞数均可增多，但LTC-IC仅为未培养细胞的50%，也明显低于扩增培养后的骨髓和脐血细胞[17]。

　　另一项研究结果表明，外周血CD34+细胞存在细胞因子高反应和低反应两种细胞群[18]。在多种细胞因子存在条件下体外扩增培养8天的外周血CD34+细胞，经荧光染料CFDA-SE（5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）和流式细胞仪筛选出低频率分裂（≤5次）细胞（即CFDA-SEbright细胞）和高频率分裂（＞5次）细胞（CFDA-SEdim细胞）。对两种细胞表面标志的分析表明，CFDA-SEbright细胞的表面抗原表达与新鲜分离的CD34+细胞相似，而CFDA-SEdim细胞则显示下调CD34抗原表达并获得分化标志，同时CFDA-Sebright部分较新分离的CD34+细胞和CFDA-SEdim细胞明显富集CD105（endoglin）阳性造血祖细胞。功能研究提示CFDA-SEbright细胞的克隆形成能力分别较新鲜分离的CD34+细胞和CFDA-SEdim细胞高3倍和10倍，此部分细胞含有绝大多数LTC-IC，比新鲜分离的CD34+细胞高2.8倍。RT-PCR和Western blot分析显示CFDA-Sebright细胞具有明显高的bcl-2RNA和蛋白水平，提示这些细胞因子低反应的循环CD34+细胞代表功能、表型、及分子水平上具有原始造血细胞前体生物学特征的多能干/祖细胞群体。

　　随着造血细胞体外扩增技术逐渐过渡到临床实验阶段，不同个体间骨髓细胞扩增能力是否存在差异的问题也开始受到重视。对小鼠的研究已经显示在不同的近交系之间，骨髓细胞长期体外培养的持续时间有很大的变化，其造血干细胞的短期和长期造血重建能力也明显不同[9]，而且利用不同鼠株间骨髓LTC-IC的差别已开始克隆影响干细胞生物学行为的相关基因[20]。进一步了解这些差异的生物学基础，可能有利于阐明造血干细胞在基因水平的调节机制[21]。

　　对人类不同个体间骨髓细胞体外扩增能力的研究报告尚少。Koller等[22]研究了52例正常供者骨髓CD34+细胞的体外扩增能力，结果显示相同数量的CD34+Lin-细胞经同样条件的扩增培养后，收获细胞的数量差别很大，其中细胞总数的变异系数（CV）为69%，GM-CFU数的CV值达90%。在有预先培养的基质细胞层存在时，这种差异可明显缩小，细胞总数和CFU-GM的CV值分别降至41%和54%。并且在基质细胞存在的条件下，不同供者的CD34+细胞显示广泛的基质依赖的进一步扩增，细胞总数增加1.2~14倍（平均3.5倍），CFU-GM数值加1.7~24倍（平均6.5倍），而改变可溶性细胞因子组合仅能够改变细胞的扩增水平，却并不能缩小不同供者间的差异。含有同样数量CD34+Lin-细胞的骨髓单个核细胞的培养，可获得数量最多且最一致的细胞总数和CFU-GM量，其CV值分别是17%和46%，这可能是由于骨髓单个核细胞可提供包括内源性基质细胞在内的辅助细胞环境所致。此研究结果对设计造血细胞培养扩增的临床实验和认识人类造血干细胞生物学行为的多样性，具有重要的指导意义。

　　对正常供者的特征如年龄、性别、体重和身高等与细胞功能的关系进行了分析，未发现有相关关系[22]。因此认为所观察到的不同供者CD34+细胞体外扩增能力的差别可能也是由于基因的多样性或其他由供者决定的变异性所致。如果这些人类细胞扩增能力的差别至少部分是由基因变异引起，那么克隆小鼠造血干细胞生物学行为相关基因的方法[21]可能同样有助于阐明有关人类造血干细胞功能基因调控的分子机制。

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