创伤愈合的细胞生物学研究进展

 　〔摘要〕　以皮肤创伤愈合为主，从创伤愈合各阶段中多种细 胞的生物学特性变化角度，综述了创伤愈合机制的研究进展。

　　创伤愈合是一个非常复杂的过程。创伤不仅使生物体局部发 生一系列变 化，同时还可引发不同程度的全身性反应；在这一过程有许多细胞参与，每种细胞又分泌多 种因子，这些细胞之间、因子之间、细胞和因子之间存在错综复杂的关系，因此它涉及细胞 运动、粘附、通讯、增殖和分化等细胞生物学的各个方面。然而创伤愈合又是一个十分有序 的过程。为叙述方便将其分为止血和炎性反应、增殖、成熟和重塑三个阶段，三个阶段互相 交叉，难以截然分开。现以皮肤创伤愈合为主综述创伤愈合细胞生物学机制研究进展。

　　1　止血和炎性反应阶段

　　创伤后首先启动的是止血过程。凝血块不仅可起止血、防止细菌侵入的作用，更重要的 是其内部激活的血小板不断分泌各种趋化因子和生长因子，可引发进一步的炎性反应并影响 参与创伤愈合的其它细胞。而互相交叉、包裹血小板的纤维蛋白则可作为愈合过程中细胞 移动的支架。

　　几乎与止血过程同时，创伤区血管内皮细胞上细胞间粘附分子(ICAM)、E-选择素、P-选 择素等粘附分子大量表达〔1〕；血液中中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞受创伤区 趋化因子趋化和细胞因子、生长因子、缺氧环境等刺激，膜表面粘附分子CD11/CD18〔 2〕、L-选择素表达也显著升高，这些细胞与内皮细胞粘附分子互相作用后，运动减慢 ，滚动、聚集并粘附于内皮层，进而穿过血管壁到达创伤区。

　　中性粒细胞是最早进入创伤区的炎性细胞，约在创伤后几分钟，其分泌的细胞因子可 能是激活局部成纤维细胞和角质细胞的最早信号。中性粒细胞积聚后，单核-巨噬细胞也开 始增多。它所释放的生物活性物质比中性粒细胞更多，作用也更强。有实验表明没有巨噬细 胞参与，伤口不能愈合。目前对这些活性物质的作用，以及作用途径进行了大量研究，如： 一氧化氮，细胞集落因子等。巨噬细胞在伤口处保留几天到几周后通过局部淋巴结排出，影 响抗原递呈〔3〕。

　　2　增殖阶段

　　细胞增殖阶段主要表现为角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞的迁移增殖分化，达到再上皮 化，形成肉芽组织。

　　2.1　角质细胞与再上皮化

　　哺乳动物表皮有多层细胞，在静息状态下细胞主要通过整合素α2β1和α3β1互 相 连接，通称角质细胞，最下层为基底细胞，基底细胞通过整合素α6β4使细胞内角质素 细胞骨架与基底膜中的层粘蛋白(laminin)，缰蛋白(nicein/kalinin)连接形成半桥粒。伤 后约12小时，创伤部位胶原酶〔4〕、纤溶酶原激活物(PA)〔5〕等蛋白水解 酶分解细胞周围的坏死组织和细胞外间质，为细胞迁移清除障碍，便于细胞在创面迁移。同 时伤口边缘的基底细胞形态及内部成分开始发生变化，一些在静息细胞中不表达的基因开始 表达，例如：早期即刻基因Egr-1、NAK-1、gro和c-myc〔6〕。细胞变平，α6 β4消失，细胞与基膜失去连接，间隙连接增加，迁移端出现α5β1，αvβ6纤 维结合蛋白(Fn)/肌腱蛋白(tenascin)受体，αvβ5玻连蛋白受体，α2β1胶原受 体和CD44透明质酸受体〔7〕，从而粘附细胞外间质向前移动〔8〕。细胞运 动时张力丝收缩，细胞内肌动蛋白肌丝插入新的粘附复合物中，收缩时使细胞运动〔9 〕。

　　角质细胞迁移的方式有多种，培养的单个角质细胞的迁移呈缓慢平移、快速多向运动和飘 移。最近有研究表明创伤后角质细胞的迁移可能有两种形式：滑动方式和蛙跳方式(leapfro g)。滑动方式是指创伤边缘的基底细胞带动其后面的与上面的细胞以细胞块的方式一起向前 移动，如果阻断迁移细胞对底物的粘附，迁移层即缩回。哺乳动物的表皮迁移还有蛙跳方式 ，即创缘细胞不迁移而其后面和上面的细胞越过创缘细胞移动，以此循环往复，直到两侧细 胞接触，有逆病毒标记证明除了基底细胞本身，基底上层细胞也能“蛙跳”过基底细胞 〔10〕。

　　引起角质细胞迁移的条件过去认为是游离边缘，但原代角质细胞在刚培养时虽有游离缘， 而不迁移，说明细胞需要被基质活化的过程。培养一段时间后表皮细胞在有游离端时就迁移 ，此时细胞迁移可以不再依赖基质，甚至在塑料上也能迁移〔7〕，这两个实验说明 游离缘和基质都是启动迁移所必需的条件。但是迁移是通过什么机制启动的尚待进一步研究 。

　　很多因素可调控再上皮化过程。生长因子如TGF-β、TGF-α、EGF、HB-EGF〔11 ，12〕、KGF等主要促进角质细胞的增殖；细胞外间质如胶原基质，FN，纤维蛋白， 层粘蛋白等主要在再 上皮化过程的不同阶段促进或抑制角质细胞的迁移〔14〕。此外，也有报道Mg2+ ，Ca2+浓度〔15〕对角质细胞迁移和分化也有影响。

　　目前对创伤如何启动角质细胞迁移，细胞如何适时停止迁移转而增殖和分化〔16〕 又适时停止增殖的机制尚不清楚。

　　2.2　内皮细胞与新生血管化

　　在创伤愈合过程中创伤部位可能产生新生血管，新生的血管为创伤部位提供氧、营养物质 和生物活性物质，因此对创伤修复起了重要作用。创伤后皮肤中新生血管化的研究几乎还是 个空白，现有的结果大多来自于无血管的角膜和胚胎发育的研究结果。创伤后新生血管化与 胚胎中血管形成起源于成血管细胞不同，是直接由内皮细胞形成，但随后内皮细胞迁移， 形成毛细血管的过程是类似的。

　　残存的血管内皮细胞在新生血管化剌激因子作用下伸出伪足，释放蛋白酶，如：胶原酶， PA降解基底膜，然后迁移，迁移前沿的细胞不增殖，后面的细胞增殖不断提供迁移的细胞〔17〕，逐渐形成毛细血管芽。阻断内皮细胞DNA复制后新生血管芽仍可形成 〔18〕，这表明血管芽主要是由迁移而不是细胞增殖形成的。现在发现新生血管化除发 芽形式外还有一种非发芽形式，即内吸收形式(intussusception)〔19〕，但在皮 肤创伤后的新生血管化过程中是否存在尚不清楚。

　　新生血管化的刺激因子有低氧，乳酸，生物胺和生长因子。前三者的作用虽早已了解，但 作用机制还不十分明确。VEGF(血管内皮生长因子)是内皮细胞专一的有丝分裂刺激因子和 趋化因子，由角质细胞、巨噬细胞等细胞分泌，其受体是酪氨酸激酶Flt-1(VEGFR-1)和Fl k-1(小鼠)/KDR(人)(VEGFR-2)，广泛分布于内皮细胞〔20〕，常与VEGF同步分泌 〔21〕，VEGF在体外可使内皮细胞PA〔22〕和胶原酶合成增加〔23 〕，也可使毛细血管融合成血管的能力增加。

　　血小板衍生生长因子(PDGF)有同源双聚体(PDGF-AA，PDGF-BB)和异源双聚体(PDGF-AB) 等三种亚型，其中PDGF -BB促新生血管化的作用最强。PDGF对不同细胞的作用不同，这可能与细胞上是否有其受体 有关〔24〕。内皮细胞分泌的PDGF不仅作用于自身，也可作用于管壁其它细胞 〔25〕，如间质细胞和平滑肌细胞的分化和分裂，从而形成完整的血管。成纤维细胞生 长因子(FGF)，也是新生血管化的刺激物，其有2种形式：酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。bFGF即FGF-2，在创伤后新生血管化的作用最强，用抗体 封闭FGF-2后伤口新生血管化过程几乎完全停止〔26〕。

　　TGF-β在新生血管化过程中可调节内皮细胞上整合素表达和细胞间质的堆积，抑制内皮 细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移、诱导间质细胞分化成平滑肌细胞。其它如血小板衍生内皮 细胞生长因子(PD-ECGF)，血管生成素(angiogenin)、血管营养素(angiotropin)、IL-8、 TNF-β也可促使新生血管化。

　　细胞外间质也是新生血管化所必需，内皮细胞上有可与细胞外间质结合的整合素受体α vβ3，αvβ3定位于内皮细胞迁移的前端〔27〕，成熟的血管无αvβ3 〔28〕，αvβ3抗体可抑制新生血管化〔29〕，αvβ3也可与 细胞外间质降解酶如MMP-2〔30〕，PAI-1〔31〕结合。另外凝血有关的 组织因子(TF)〔32〕和因子V〔33〕对新生血管化也有影响。

　　2.3　成纤维细胞与肉芽组织形成

　　成纤维细胞在肉芽组织形成和成熟过程中表现出不同的特性。第一种特性是增殖、迁移。 成纤维细胞的迁移、肉芽组织的产生一般在创伤后需3天左右准备期，在这期间，细胞外间 质发生变化(如纤维蛋白凝块形成等)，细胞激活，为肉芽组织形成创造了条件，这段时间的 长短取决于成纤维细胞由静息状态进入活化状态的时间〔34〕。成纤维细胞迁移到 伤口后，内质网和高尔基体开始扩散到整个细胞质并开始释放胶原、FN等细胞外间质和TGF -β等，表现为分泌特性。伤后约1周，成纤维细胞几乎占据整个伤口，其中有些开始并持 续表达α-平滑肌肌动蛋白索，称张力纤维，呈现收缩特性，为肌成纤维细胞。伤后约4周 ，伤口处成纤维细胞和内皮细胞等发生凋亡而数量减少〔35〕。目前尚不清楚成纤 维细胞几种特性之间的转化机制。

　　关于成纤维细胞运动机制最近有报道称可能与肌动蛋白纤维的聚合和重排有关。生长因子 (如PDGF，FGF)及胰岛素等外界信号作用于成纤维细胞膜上相应受体，激活G蛋白Rac或Rho， Rac激活凝血溶素(gelsolin)，凝血溶素对肌动蛋白起切割和加帽作用，此举可使肌动蛋白 聚合和重排。通过转基因作用KNOCK OUT(基因剔除)小鼠凝血溶素基因，可使成纤维细胞 迁移能力减弱〔36〕。Rho则可刺激张力纤维和粘附平板的形成，张力纤维末端与 胞膜连接形成粘附平板，粘附平板含辅肌动蛋白(α-Actinin)，粘着斑蛋白(Vinculin)等 ，可通过膜上整合素，钙调素粘附于基质或其它细胞，张力纤维收缩细胞运动。

　　趋化因子、生长因子和细胞外间质对成纤维细胞作用已有很多研究，最近发现TGF-β家 族的激活素(activin)〔37〕也能促进成纤维细胞的迁移和增生。另外成纤维细胞 同时受生长因子和细胞外基质双重调节：体外将成纤维细胞培养于Fibrin-FN凝胶中，PDGF 可促进其α3、α5整合素亚单位的表达，而培养于胶原凝胶中时，PDGF却促进α2亚单位的 表达。

　　3　成熟和重塑阶段

　　创伤愈合的最后一个阶段是基质的成熟和重塑期，这一阶段需经历相当长的时间，伤口外 观可能出现疤痕。疤痕形成机理以及如何减轻甚至无疤痕愈合是人们一直关心、不断研究的 问题，至今的工作大多围绕在成人和胚胎(有疤痕愈合和无疤痕愈合)，人和动物(收缩少和 收缩多)、皮肤和其他器官(不能再生和能再生)创伤愈合时一些病理及生化指标的比较上。

　　人们曾经猜测胎儿与成人伤口愈合不同的原因在于有温暖、潮湿、无细菌感染、相对低氧 以及独特内分泌和细胞因子的子宫环境，但已有证明，成人皮肤移植到子宫内的胎儿中仍会 引起疤痕〔38〕，而有袋动物胎儿在无子宫环境下伤口愈合时也无疤痕产生〔 39〕，另外将人胎儿皮肤移植到成年裸鼠皮下也可无疤痕愈合〔40〕，更重要 的是大部分动物妊娠早期是无疤痕愈合而晚期则是有疤痕愈合，这些实验充分说明子宫环境 并不是无疤痕愈合的必要条件。

　　疤痕产生的机制可能很复杂，与许多因素有关。对TGF-β家族的研究表明，应用TGF-β 1、TGF-β2抗体可减少疤痕〔41〕；过量使用TGF-β3〔42〕(具 有减轻TGB-β1、β2的作用)也可减少疤痕形成；在肾，肺，肝脏等器官类 似于皮肤疤痕增生的纤维化时，TGF-β也显著增加〔43〕。而胎儿伤口愈合中TGF -β却明显较成人少，这些说明TGF-β家族在疤痕形成中可能起某些作用。

　　胶原与疤痕增生有关已很早为人们所知，在疤痕组织中可见胶原不规则排列。过去一直认 为疤痕是由于胶原，特别是Ⅰ型胶原过量产生的结果。但问题并非如此简单，有报道在疤 痕中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例并不是增加而是减少〔44〕；疤痕中胶原合成所需的脯氨酸 羟化酶和交连所需的赖氨酰氧化酶活性虽有所增加，但分解胶原的胶原酶活性也增加〔 45〕，而且可溶性胶原增加而交联胶原却较少〔46〕；在胎儿创口中胶原合成 比成人还快〔47〕；因此胶原是否为疤痕增生的原因尚未肯定，但可以肯定的是疤 痕中胶原合成和代谢失调。

　　氨基多糖和蛋白多糖也可能是疤痕形成的因素之一，它们可以与胶原结合而调节胶 原沉积和分解，也可影响细胞增殖、迁移和胶原的合成。Hardingham等〔48〕报道 ，在正常皮肤中硫酸软骨素比疤痕中少，尤其是4-硫酸软骨素。胎儿伤中透明质酸和透明 质酸刺激因子(HASA)明显多于成人〔49〕。

　　人们还注意到在胚胎伤口愈合中不出现急性炎性反应。炎性反应时巨噬细胞可以释放大量 细胞因子引起成纤维细胞增殖和胶原合成，这可能是疤痕形成的另一因素。

　　可见胎儿伤口愈合与成人不同的原因至今还是个谜，也许在了解其中真正原因 之际也正是彻底解决疤痕增生问题之时。

　　创伤愈合的研究已取得了很大进展，特别是近几年来，随着细胞和分子生物学研究手段和 方法的不断改进和完善，创伤愈合的研究也已从单纯对伤后形态学，生化变化的研究发展到 对引起变化的机制研究。相信今后的几年创伤愈合的研究将更加激动人心并更加深人们对细 胞和分子生物学的理解。

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