摘要 目的：观察庆大霉素慢性耳中毒前后蒙古沙鼠内侧橄榄耳蜗（medial olivocochlear,MOC）传出神经的形态改变及其与毛细胞损害的关系，以探讨MOC传出神经在氨基糖甙类抗生素慢性耳中毒中的重要性。方法：采用改良的乙酰胆碱酯酶组化染色和甲苯胺蓝-苏木素染色法，全耳蜗铺片观察健康对照组和庆大霉素组耳蜗MOC传出神经和外毛细胞（outer hair cell，OHC）的分布特征，并测量耳蜗MOC传出神经纤维、末梢及OHC的数量。结果：停药后3周出现耳蜗MOC纤维和末梢损害，损害程度随观察时间延长而加重，11周最明显, 且损害部位主要在耳蜗底回，与毛细胞损害的特征一致。结论：耳蜗MOC传出神经可能在庆大霉素慢性耳中毒时OHC的损害中起重要作用。
氨基糖甙类抗生素耳中毒的确切机制尚不明。近年来形态学和电生理研究证明，听觉感受与传入活动受内侧橄榄耳蜗（medial olivocochlear, MOC）传出神经系统的支配和调控［1,2］，同时还发现氨基糖甙类抗生素急、慢性耳中毒时MOC功能明显损害［1-3］，提示氨基糖甙类抗生素耳中毒可能与听觉传出神经系统损害有关。本研究采用乙酰胆碱酯酶组化染色法，观察庆大霉素慢性耳中毒后MOC传出神经纤维和末梢的形态改变，报道如下。
材料及方法
一、动物分组
蒙古沙鼠36只，雌雄不限，体重50～60 g，外耳道及鼓膜正常。庆大霉素组24只，每天肌注庆大霉素150 mg/kg，连续10 d，分别于停药后3、7和11周处死，每个观察时间8只；健康对照组12只，与庆大霉素组同批处死，每个观察组4只。每只动物1耳行MOC传出神经染色，另1耳行毛细胞染色。
二、MOC传出神经染色
按以往采用的乙酰胆碱酯酶染色方法［4］，动物注射1％戊巴比妥钠麻醉后，断头处死，迅速取出听泡，用0.1 mol/L磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，pH7.4）洗去血液后，置于4℃固定液（4％多聚甲醛,0.5％戊二醛,0.2％苦味酸）中，立即去除镫骨，开放卵圆窗和圆窗，蜗尖钻孔，将固定液分别从蜗尖和两窗灌注，置4℃冰箱中继续固定过夜，经0.1 mol/L EDTA-Na2 （ethylene diamine tetraac-etic acid，乙二胺四乙酸）脱钙3 d，每天换液1次。然后去除蜗壳、螺旋韧带、盖膜，并分割成底回、第二回和蜗顶3段，室温下行组化染色。首先经0.1％H2O2 处理30 min，0.1 mol/L PBS 漂洗，后用1％Triton X-100处理1 h, 0.1 mol/L马来酸缓冲液(pH 6.0)漂洗，再置组化反应液（含35μmol/L碘代乙酰硫化胆碱、5μmol/L K3Fe(CN)6 、30μmol/L CuSO4、50μmol/L枸橼酸钠）中作用50 min，经50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）漂洗后置标记染色液（0.04％二氨基联苯胺和0.3％硫酸镍铵）中作用5 min，再置含0.003％H2O2的同一溶液中继续染色10～15 min, 最后在5 mmol/L Tris-HCl中漂洗，中止反应。标本染色后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
三、毛细胞染色
按Ulehlova等［5］的甲苯胺蓝-苏木素染色方法改良，过程如下：动物麻醉后断头处死，迅速取出听泡，用10％甲醛溶液从圆窗、卵圆窗灌注，后固定24 h，经0.1 mol/L EDTA-Na2脱钙，按上述方法制备标本后染色。先经0.1 mol/L PBS漂洗后, 在含1％乙醇的甲苯胺蓝饱和溶液中染色20 s, 0.1 mol/L PBS漂洗, 再经苏木素溶液中复染1min，0.1 mol/L PBS漂洗, 甘油封片。
四、结果分析
在网格测距器下计数并对比分析健康对照组和庆大霉素组第3、7和11周耳蜗底回、第二回和蜗顶MOC传出神经纤维、末梢及外毛细胞(outer hair cell，OHC)的数量，计算平均值，各组间差异行t检验。
结果
一、MOC纤维和末梢在耳蜗的分布
健康对照组MOC纤维及其末梢的密度和大小在耳蜗各回的分布不一致。在底回起始端纤维短，底回中部纤维细长，神经末梢小，其分布较稀疏（图1），底回远端和第二回神经纤维和末梢密而粗大,至蜗顶部相对稀疏而细小。庆大霉素停药后3周底回起始端和中部MOC纤维及末梢部分消失，第二回无明显变化；7周底回起始端和中部MOC纤维和末梢大部分消失(图2)，跨隧道纤维减少，第二回纤维和末梢部分消失；11周底回起始端和中部MOC纤维和末梢基本完全消失，仅在远端残留少量MOC纤维, 第二回和蜗顶的纤维和末梢也明显减少，跨隧道纤维稀少。定量分析显示耳蜗MOC纤维和末梢损害依不同部位和观察时间而异，损害程度随观察时间延长而加重,以耳蜗底回和停药后11周损害最显著，差异有显著性(P＜0.001，图3,4)。
图1 健康对照组MOC纤维和末梢在耳蜗底回的分布。×100
图2 停药后7周耳蜗底回MOC纤维和末梢大部分消失。×100
图3 健康对照组和庆大霉素组停药后不同时间MOC纤维在耳蜗的分布（100 μm基底膜MOC纤维平均值）。*P＜0.001，下图同
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