定量病理学技术在大肠癌研究中的应用进展 2

仪对悬液中流动的荧光标记的大量单细胞进行快速精确的定量分析技术；另一种是胸态图像分析术，如图像分析仪、显微荧光光度计、显微分光光度计等，它是对显微镜下的静态细胞图像进行定量分析。夏潮涌报道目前主要采用流式细胞术（FCM）和细胞图像光度术（ICM）测量和分析细胞学样品单个完整肿瘤细胞的DNA含量的倍体，国际分析细胞学会和国际细胞学会分别为FCM和ICM作细胞核DNA含量与倍体分析推荐了统一标准[19]。Diest在评价ICM的应用时提出：虽然ICM测量速度不如FCM快，但它可以直观地检测细胞，随时测量其结构特征，在发现少有的核变化上优于FCM[20]。97年国际定量病理会议讨论了FCM在人体实性肿瘤的诊断和预后价值，并指出FCM在肿瘤发生前能提供客观诊断资料；在早期癌检测中能提高诊断效果；在确定大多数肿瘤的预后、复发、死亡等方面有显著的临床价值[21]。在DNA定量分析方法的标本应用方面除了切片外也可作涂片、印片等可作参考。

　　2.3 DNA定量分析在大肠癌发生发展及诊断中的应用

　　大肠肿瘤并非由正常细胞一跃而成为癌细胞，通常需有量变到质变的发展过程。大肠腺瘤被认为是大肠癌的主要来源，分析癌前细胞DNA的含量变化有助于探讨癌变的发生发展规律。国内外大量病理和临床研究资料表明：肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤的重要标志之一，DNA异倍体出现是肿瘤生物学行为恶性、预后不良的重要特征，测试胞核DNA含量并进行倍体分析对恶性肿瘤的病理诊断、分类分级、预后判断有重要价值[22，23]。研究发现[24]：大肠腺瘤样息肉病例肿瘤细胞DNA含量均在正常范围内，但当腺瘤样息肉伴有不典型增生和癌变时，细胞核平均DNA含量呈递增趋势，但是正常粘膜、腺瘤、腺癌各组间有较大的重叠。Seiynu等[25]人用流式细胞仪分析大肠癌细胞时发现：DNA非整倍体在腺瘤阶段已发生，这一结果不但支持了腺瘤→癌模式的理论，而且表明DNA非整倍体可能是结肠息肉恶变诊断的早期指标之一。DNA非整倍体在恶性病变前二年即可检测到[26]。有报道某些溃疡性结肠炎可以不经过异型增生阶段直接发生癌变，此时DNA倍体分析显得更有意义[27]。Hammarberg报告[28]活检系轻度不典型增生、DNA含量明显增高且DNA直方图呈二个异倍体细胞群的慢性溃疡性结肠炎，一年后复查发现相应部位发生肿瘤，为中分化腺癌；此外慢性溃疡性结肠炎异倍体随病程延长而增加，异倍体发生率与癌变率平行。郑香玲等研究认为：恶性肿瘤的分化程度与DNA含量和倍体类型有关，分化程度越差其DNA的含量越高，高、中、低分化腺癌细胞核DNA的非整倍体不断增多，DNA含量直方图峰值向右偏离，而良性肿瘤细胞DNA含量高于正常细胞，4倍体增多[29]。

　　2.4 DNA定量分析与预后

　　肿瘤细胞核DNA含量与临床预后有明显关系，一般认为DNA倍体量的变化与临床预后的时间长短成反比。Roguum检测了100例大肠癌术后患者，发现二倍体细胞患者五年生存率明显高于非整倍体细胞患者，他认为非整倍体细胞是影响预后的一个独立因素，他还证实Dude'sD或C期患者非整倍体更常见，预后差[30]。而Thomas等人则认为：肿瘤细胞DNA含量依然是一个有争议的预后指标，DNA含量没有单独提供额外的预后信息，大肠癌预后由临床和组织病理学指标所决定，即取决于肿瘤的部位、肿瘤浸润深度、淋巴结的转移以及病理分级[31]。Reiping等人在研究大肠癌DNA倍体和流式细胞计数与组织病理学参数及预后的估价时批出：DNA倍体的类型同一些组织病理学指标改变相关，即与肿瘤的部位、恶性度的病理分级、血管淋巴管的浸润及淋巴结的转移等有关。如：远端结肠癌的非整倍体较近端的非整倍体为多，病理分组中恶性度高的多为非整倍体，二倍体肿瘤多局限于粘膜下层且很少与淋巴结转移有关，有血管淋巴管浸润的结直肠癌非整倍体更高，但流式细胞计数同病理分级的各级大肠癌病人的生存期无关[32]。还有研究表明：DNA非整倍体与大肠癌的生物学行为相关，为不良预后的一个可靠参数[33]。总体来看，大肠癌细胞核DNA含量的升高，非整倍体出现与预后的关系不可忽视。

　　3 大肠癌的核仁组成区相关嗜银蛋白（AgNORs）定量

　　3.1 AgNORs理论含义

　　核仁组成区（NORs）是DNA的一个片断，即18S、28S、核糖体基因（rDNA）的分布区。在人类它们位于五对近端着丝点染色体（13、14、15、21、22）的次缢痕处，是形成核仁的部位，故与细胞增殖有关。NORs可用银染技术显示，因银与rRNA相关的酸性非组蛋白结合，形成银染阳性的NORs颗粒（AgNORs）。AgNORs可作为NORs及其rDNA转录活性的标志，可用来反映核仁结构和转录功能的变化[34]，为定量分析细胞增生和分化提供信息。

　　3.2 AgNORs定量测定方法

　　AgNORs定量测试和表达方法不统一。国内已有学者提出有关AgNORs计数的标准化方案[35]。

　　3.3 AgNORs定量在大肠癌发生发展和诊断中的应用

　　国内外研究结果表明大肠肿瘤细胞核内AgNORs的数量随上皮细胞增生程度的递增而增高，即癌AgNORs＞腺癌AgNORs＞正常粘膜AgNORs，并且也随癌细胞分化程度的增高AgNORs计数而逐渐降低。Morais等人对大肠隐窝上皮按长轴方向由表及里分成表层、中间层和增生层，用AgNORs的量化指标分析其规律，他用的量化参数为：核仁组成区的体密度（VV）、面数密度（NA）,结果显示：VV和NA在增生层最高，至表层依次降低，认为这两个参数能作为大肠上皮增生潜能的客观指标，并指出NA在探测切片的区别时比VV更敏感。该研究表明：体视学与AgNORs定量分析相结合对于估价组织正常分化和增生形式以及预测肿瘤组织以增生为特征的生物学行为有较高的价值，并提示在人体正常大肠隐窝不同分层切片AgNORs定量可作为增生的标志[36]。一些研究表明：AgNORs面积检出的结果比颗粒计数的结果更为确切，更符合AgNORs量变的理论规律。在腺瘤癌变过程中，AgNORs和DNA含量的显著性增加并非完全同步，轻、中度异型腺癌发展为重度异型时AgNORs含量就显著性增加，而DNA含量却无显著性增加，因此有学者认为AgNORs含量的显著性变化是腺瘤早期恶变的信号。曾桃英等人研究大肠粘膜、癌旁粘膜、腺瘤、腺癌的AgNORs含量时，发现上述四组AgNORs计数及直径均值虽然依次呈递增关系，但各组之间的差异用t、u方法检