成蚊对虫媒病毒中肠感染屏障及其机理的研究进展

　　关于虫媒病毒感染蚊虫的基本机制，目前已经了解的比较清楚。一般来讲，随血液进入蚊体的病毒首先进入中肠上皮细胞进行复制，之后释放入血淋巴，继而感染唾液腺，通过蚊虫叮咬或吸血传播。在这一系列过程中，许多研究者认为中肠屏障是一非常重要的因素。早在60年代初，Chamberlain等〔1〕就提出了“中肠屏障”的概念。Hardy等〔2〕经过详细分析，总结出蚊虫感染病毒后，在不同层次存在中肠感染屏障、中肠释放屏障、涎腺感染屏障、涎腺释放屏障和经卵传递屏障。其中，中肠感染屏障或感染阈值现象，是限制许多病毒感染无脊椎动物媒介的一个重要因素。下面将重点讨论蚊虫对虫媒病毒的中肠感染屏障、影响因素、作用机制以及在蚊虫防制中的潜在意义。

　　1　中肠感染屏障

　　虫媒病毒经口感染蚊虫，很明显是在中肠水平上突破病毒剂量依赖性“感染阈值”而达到目的。须超过这一阈值的血中病毒滴度，常因蚊种和病毒的不同而具差异。在某些情况下，一些蚊种对常见滴度的脊椎动物病毒血症表现为完全不感染。这种对经口感染所表现的阈值屏障，不管是部分的还是完全的，在几篇文献中已被命为“肠”、“中肠”或“中肠感染”屏障〔3〕。

　　蚊虫对虫媒病毒中肠感染屏障的存在，最早是由Merrill和TenBroeck提出的〔4〕。他们发现埃及伊蚊(Aedes aegypti)吸血后对东方马脑炎(Eastern equine encephalomyelitis, EEE)病毒完全不感染。而如果将病毒直接接种到血淋巴或吸血后立即穿刺胃部，则该蚊可以传播EEE；在其他蚊虫与病毒的关系中也观察到这种现象。例如，McLean等〔5〕注意到经口、经胸接种Cx.annulirostris后，墨谷脑炎(Murray vally encephlitis,MVE)病毒可在其体内繁殖；而An.annulipes只有经胸接种后，MVE才能在其体内增殖。Hardy等〔6〕发现马来亚伊蚊(Aedes malayensis)、伪杂鳞库蚊(Cx.peudovishnui)、淡色库蚊(Cx.pipiens pallens)和环跗库蚊(Cx.tarsalis)对经胸接种的西方马脑炎(Western equine encephalomyelitis,WEE)病毒同样易感，而只有马来亚伊蚊和环跗库蚊可经口感染WEE。提示中肠层次的屏障决定了蚊虫经口感染病毒的易感性。

　　除不同的蚊种对病毒存在易感性差异外，同一蚊种的不同地理株间亦存在差异。同一蚊种内经口感染的抗性株同样与中肠感染屏障有关。野外和实验室的环跗库蚊株经口感染WEE后，表现出不同的易感性；而经胸接种后，则无甚差别〔4，7〕。同样，自然界中亦存在白纹伊蚊(Aedes albopictus)〔8〕和埃及伊蚊〔9〕对登革2型和登革3型病毒的抗性株。另外，野外收集和实验室的环跗库蚊克隆株以及基因筛选的经口感染WEE的抗性株，在经胸接种后具有同等的易感性，证明了中肠感染屏障的存在。

　　2　中肠感染屏障的影响因素

　　2.1　病毒剂量　蚊虫吸食感染性血液后，血液沉积于后中肠部位，此部位包括一层上皮细胞。病毒需首先感染上皮细胞，才能进而复制并散播。有几篇文献已明确阐明“中肠感染阈值”现象，即病毒在蚊虫中肠的初始感染过程中，需要雌蚊吸入足够量的病毒以突破“感染阈值”〔10〕。突破这一感染阈值所需的血中病毒滴度，在不同的虫媒病毒与蚊虫系统之间有着很大的差异〔1〕。目前，人们认为在最适宜条件下，某一虫媒病毒的自然媒介对该病毒具有一最低的感染阈值，但对那些靠经卵传递来维持或常靠其脊椎动物宿主产生高滴度病毒血症的某些病毒来讲，情况并非如此。蚊虫经口感染的病毒滴度，不仅影响初始感染上皮细胞的数量，而且进一步影响病毒在细胞内的复制与传播。许多研究者已观察到很多种蚊虫感染一定量的病毒，且经一定的潜伏期后不能传播病毒，多因病毒感染剂量低或因而造成的雌蚊体内复制的病毒量太低所致〔6〕。

　　2.2　外潜伏期温度　不仅血中病毒滴度影响初始感染，外潜伏期温度对于虫媒病毒的感染亦有不可忽视的影响。在允许病毒复制的温度范围内，温度升高病毒感染蚊虫的机率增大。已有的研究资料表明，外潜伏期温度对不同蚊虫—病毒系统的中肠释放屏障具不同的影响〔11-12〕，这可能因不同温度对病毒复制的影响存在差异有关。而外潜伏期温度是如何影响中肠感染屏障的，报道甚少。

　　2.3　协同感染　蚊虫对病毒中肠感染屏障的存在，使一些蚊虫不能成为病毒的有效媒介。但近年来的研究证实，某些寄生虫与病毒的协同感染，亦可大大提高蚊虫对病毒的感染率及传播效率〔13-17〕。

　　在自然界，某些虫媒病毒的脊椎动物宿主(包括人)通常也会感染淋巴丝虫。现已证实，淋巴丝虫的微丝蚴与虫媒病毒同时感染蚊虫，可使病毒突破中肠屏障而增强其感染率〔13-18〕。Turill等〔13〕在研究微丝蚴Brugia malayi与RVF(Rift Valley Fever)病毒协同感染Aedes taeniorhynchus的关系时，认为有两种因素使Aedes taeniorhynchus传播RVF病毒的能力增强：一方面微丝蚴简化了病毒感染蚊虫的过程，即微丝蚴在逃逸的同时，使协同感染的部分病毒不必粘附、侵入、复制，并于中肠上皮细胞释放入血淋巴；另一方面，因为病毒不需在中肠细胞内完成复制循环再进入血淋巴，而大大减少了Aedes taeniorhynchus传播RVF病毒的外潜伏期时间。Jefferson等〔18〕进行Brugia微丝蚴与EEE病毒协同感染伊蚊的研究时发现，并非任何情况下微丝蚴都能起到增强病毒感染的作用，这种作用具剂量依赖性。必须有足够数量的微丝蚴和适宜的血症病毒滴度，才能使微丝蚴传送最低感染剂量的病毒进入血淋巴，从而提高感染率；而这一过程必须的条件，同一蚊种内亦存在差异。

　　寄生虫与病毒协同感染的增强作用，具有不可忽视的流行病学意义：无效媒介可以成为有效媒介；引起蚊虫感染所需的最低病毒剂量会因此大大降低，从而使保存宿主(低级病毒血症)成为有效宿主；病毒在蚊体内经历的外潜伏期大为缩短等〔17〕。因此，在研究蚊虫对病毒的中肠感染屏障时，不能忽视寄生虫与虫媒病毒协同感染作用。

　　3　中肠感染屏障的内在机制

　　关于中肠感染屏障的机制，目前有几种解释〔2，10，19〕，主要包括：中肠消化酶对病毒的灭活作用；围食膜的闭合阻挡；中肠细胞缺少特异病毒受体或受体数量较少。为证实或否定这些推论，Hardy及Houk等〔6，22〕首先以环跗库蚊和尖音库蚊(Cx.pipens pipens)分别作为WEE病毒易感和抗性种间模型，并以遗传筛选的环跗库蚊WEE敏感株和抗性株作为相应种内模型，进行了系列试验，下面将从几方面探讨各有关推论。

　　3.1　中肠消化酶的影响　近几年对蚊中肠消化酶的产生及分泌时间、编码基因的序列等研究较多，但对虫媒病毒的影响研究不多，对于病毒在蚊虫中肠腔内的命运所知甚少。很多研究已证明蚊虫吸血后，中肠内会产生胰酶、胰凝乳蛋白酶等消化酶。有人认为这些酶可能对虫媒病毒具有灭活作用，从而影响病毒感染蚊虫中肠。可能蚊虫中肠内的酶亦可影响虫媒病毒表膜的完整性，从而使病毒失去感染力。蛋白酶如哺乳动物的胰酶或胰凝乳蛋白酶可使几种虫媒病毒失去活力〔21-22〕。但不同的病毒受胰酶或胰凝乳蛋白酶的影响不同，因此不同蚊种、株中肠内两种酶浓度和产生时间的不同，均会对病毒产生不同的影响，进而影响不同蚊虫对病毒的易感性。如白足按蚊(An.albimanus)等按蚊中肠内的胰酶，在蚊虫吸血前已存在于中肠细胞内〔23〕，羽化后1～2d达高峰(约为吸血后峰值的40%)，在吸血后14h达峰值，随血液消化而降低。但消化完毕仍持续存在于中肠，直到下一次吸血。胰凝乳蛋白酶在其吸血后才产生。而伊蚊属蚊虫直到吸血后4h才开始产生胰酶和胰凝乳蛋白酶，8h后胰酶达峰值。是否因两种蚊虫消化酶产生时间和浓度的不同而导致对虫媒病毒(如登革病毒)易感性的差异，是一个值得探索的问题。

　　虽普遍认为蚊中肠消化酶对病毒有致弱作用，但Ludwig等〔14〕利用C6/36细胞、来自LACV病毒自然媒介三列伊蚊的MAT细胞和非媒介致倦库蚊Cq细胞，对酶处理的LACV病毒进行感染试验却发现，胰酶或链霉蛋白酶处理LACV病毒后，可增强病毒对蚊虫细胞的亲和性，从而提高了病毒对非媒介蚊虫细胞的感染能力。其中病毒主要表膜糖蛋白G1被证明可与脊椎动物细胞受体结合，表膜糖蛋白G2则与蚊虫中肠上皮细胞结合，而G1与G2均可与体外建立的三列伊蚊的MAT细胞系结合。在蚊中肠消化酶环境内，这些酶也许将该病毒表膜主要糖蛋白G1消化掉，而将G2完整保留；或因病毒糖蛋白的降解，而将病毒粘附蛋白暴露于病毒表面，以使病毒可粘附并感染蚊虫中肠上皮细胞。因此，关于中肠消化酶对病毒的灭活作用不能一概而论。

　　3.2　围食膜对病毒的闭合与阻挡作用　关于围食膜的屏障作用已在另文详述。大多数作者认为围食膜可限制虫媒病毒的传播〔2，25〕。但对于吸血几分钟后即侵染中肠上皮细胞的虫媒病毒，围食膜并不能及时形成而阻止其感染，因为围食膜的最终形成往往需要一定的时间，且具有种、株特异性〔26-28〕。因此，有些学者则认为中肠围食膜对病毒感染并没有完全的阻遏作用，至少不能解释某些蚊虫对病毒的完全不应性，仅可能增加了中肠感染屏障的感染阈值。

　　与围食膜的屏障作用相反，围食膜的形成在作为病毒逃逸屏障的同时，也许增加了血液中病毒粘附的机会，以防随排泄物排泄掉，从而提高了病毒侵染上皮细胞的机率。因某些寄生虫(如梨形虫)可在消化残渣里滞留，直到PM降解再侵染上皮细胞〔29〕。病毒亦可能存在类似情况，仍有待于进一步研究。

　　3.3　病毒受体位点　近年来关于虫媒病毒细胞受体的研究与日俱增。许多研究表明，病毒只有与宿主或媒介的细胞受体结合后才能进入细胞内，而且病毒受体的分布与病毒感染宿主动物的范围有关。媒介及宿主对病毒的易感性取决于病毒粘附于细胞表面和穿过浆膜的能力〔30〕。

　　对于虫媒病毒与蚊虫细胞受体粘附的生化特性仍不清楚。然而，受体的存在及其在中肠上皮细胞的分布，毫无疑问对虫媒病毒感染蚊虫至关重要。中肠上皮细胞缺少特异性受体，似乎可以解释尖音库蚊对WEE的完全不应性。通过感染试验、免疫荧光和电镜等对吸入大于106PFU的病毒量，且在26℃条件下饲养的尖音库蚊进行研究，直到144h仍不感染病毒。然而，有人认为免疫荧光和电镜对检测少量的吸附于或进入细胞的病毒或缺陷型复制病毒不敏感〔2〕。但最近的免疫荧光及电镜研究表明，在血食中加入DEAE葡聚糖或经胸接种WEE，则尖音库蚊可感染该病毒〔12〕。这些结果说明尖音库蚊对WEE的中肠感染屏障与病毒的粘附、进入及病毒复制的脱壳过程有关，并非病毒不能在中肠上皮细胞内繁殖。在血食中加入DEAE葡聚糖，亦可增加其他几种虫媒病毒对埃及伊蚊的感染性〔31〕。可能因为带正电荷的DEAE葡聚糖降低了带负电荷的病毒表膜与细胞之间的静电排斥。

　　现在已在许多病毒及其宿主之间证实了这种特异性受体的存在，并且对其受体与配基之间的结合机理进行了深入研究。但对于媒介蚊虫细胞受体的研究仍仅在探索阶段。Ludwig等〔32〕通过一系列病毒感染、结合实验等证实，LACV病毒主要通过病毒表膜蛋白与细胞受体的相互作用而感染猴肾及蚊虫细胞。其中，LACV利用主要表膜糖蛋白G1粘附于脊椎动物细胞，而主要通过G2糖蛋白粘附于蚊虫中肠细胞。LACV的自然媒介三列伊蚊的细胞系则可与病毒的G1及G2糖蛋白结合，因其表面存在G1或G2的受体位点。另外，G2可与三列伊蚊媒介的中肠体外结合，亦说明蚊虫中肠细胞存在受体位点。并认为不同媒介的细胞受体存在与否，也许可作为媒介效能的一种合理的指标，或为组织感染屏障的一种生化基础。

　　目前对于登革病毒的初步研究亦表明，登革病毒在体内、体外对人体及蚊虫细胞表现出不同的细胞向性(亲嗜性)，相同或不同细胞的病毒特异性受体影响着病毒的细胞亲嗜性。Juans等〔33〕已从C6/36细胞分离到登革4型病毒结合蛋白，证明C6/36细胞表面的40kD及45kD两个糖蛋白可与登革4型病毒特异结合，并初步判定为登革病毒特异性受体或受体复合物成分。而Munoz等〔34〕则利用标记病毒或细胞膜蛋白进行病毒与蛋白杂交及亲和层析等试验，结果发现，埃及伊蚊中肠及C6/36细胞膜的80kD和65kD蛋白在登革病毒与细胞的结合中具有重要作用。过去的一些研究提示，埃及伊蚊和白纹伊蚊的某些地理株对登革2型病毒经口不感染，中肠感染屏障是影响这些地理株经口感染登革的屏障因素。从上述关于受体的研究可以看出，受体很可能是决定中肠感染屏障的主要因素。

　　4　结语

　　总的来讲，关于中肠感染屏障及其他屏障的机制，仍存在很多疑点。如病毒是如何粘附于并穿过中肠上皮细胞的?影响中肠感染等屏障的遗传机制是什么?自然界的温度变化是如何影响这些感染释放屏障、外潜伏期长短及媒介效能的?是否这些机制普遍存在于自然界的虫媒病毒—蚊虫系统中?对这些问题至今还没有一种比较完美的解释。很有可能这些屏障也代表了蚊虫的一种免疫反应，如果真是这样，阐明这些机制将有助于丰富人类关于昆虫媒介免疫的知识，从而更有利于进行蚊虫媒介及虫媒病毒等疾病的有效防治。

　　作者单位：军事医学科学院微生物流行病研究所(北京100071)

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