哺乳动物硒蛋白的研究进展

　　摘要 硒是哺乳动物和人必需的微量元素。硒的生物学功能主要是以硒蛋白的形式表现的。到目前为止，已经克隆并测定cDNA顺序的哺乳动物硒蛋白有9种，它们是细胞内谷胱甘肽过氧化酶、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶、胃肠谷甘肽过氧化物酶。Ⅰ型碘化甲状腺原氨酸5’脱碘酶、硒蛋白P和硒蛋白W。这些硒蛋白中硒参入到蛋白分子是通过硒半胱氨酸-tRNA识别mRNA中特异的UGA密码子将硒半胱氨酸插入硒蛋白中。

　　关键词 硒；硒蛋白；生物功能；表达调控

　　Progress in the of Mammalian Selenoprotein ZHANG zai-Xiang, YANG Xiao-Guang, XIA Yi-Ming, CHEN Xiao-Shu (Institute of Nutrition and Food hygiene, Chinese academy of Preventive Medicine ,Beijing 100050)

　　Abstract Selenium is am essential trace element for animals and humans. Selenium exerts its biological function largely through selenoproteins .Up to now nine selenporoteins’ cDNAs have been cloned and sequenced, which are cellular glutathione peroxidase (cGPX), extracellular glutathine peroxidase (eGPX), phospholipid hydroperoxidase glutathione perxidase (PHGPX), gastrointestinal glutathione peroxidase (GPX-GI), type I iodothyronine5’ -deiondenase (IDⅠ) type 2 iodothyronine5’deioninase (IDⅡ),type Ⅲ iodothyronine5-deiodinase(IDⅢ),selenoprotein p (SeP) and selenoprotein W. In all these selenoproteins Se is incorporated into the protein molecule via the selenocysteinyl-tRNA which recognizes the specific UGA codons in mRNA to insert selenocysteine into the primary structure of selenoproteins.

　　Key words Selenium; Selenoprotein; Biological function; expression and regulation

　　硒（Se）是1817年瑞典学者Berzelius发现的性质似硫的元素。直到1957年Schwarz和Foltz才证实Se是动物必需的微量元素。硒与人类和其它和动物的生长、发育和疾病的发生有着密切联系。硒已成为当代国际上研究微量元素与健康问题上十分突出的兴奋点。我国在硒与克山病关系的研究上取得了举世瞩目的成果。当前硒蛋白作为硒表现其生物学作用的主要形式已成为学者们研究的热门课题，且近几年进展迅速。目前，有9种哺乳动物硒蛋白cDNA已克隆和测序，有证据表明还有更多的硒蛋白存在[1]。本文将简要回顾9种硒蛋白的研究历史，阐明它们的特点及分布、生物学功能和表达调控方面的进展。

　　一、硒蛋白研究的历史回顾

　　硒蛋白的研究只有二十多年的历史，其中近10年来取得了巨大成果。1973年Hoedstra实验室的Rotruck首次证明细胞内谷胱甘肽过氧化物酶是一种含硒酶，硒是该酶的活性组份。因此，细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（cGPX）是在哺乳动物体内发现的最早的硒蛋白。自此，对硒代谢作用的了解有了突破，大量工作致力于对cGPX功能的研究。在很多年内它是已知的唯一的硒生化物化学功能的代表，因而用来作为评价硒的营养状况的指标。

　　细胞外谷胱甘肽过氧化物酶（Egpx）在70年代被认为与红细胞内cGPX是同一种蛋白质。1985年Cohen等发现二者不是一种蛋白质。1987年Takahashi[2]等从人血浆中分离纯化了这种蛋白质，发现它在免疫、化学、电泳和某些功能上均不同于cGPX，因存在于血浆中将其命名为外谷胱甘肽过氧化物酶（Cgpx）。

　　磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPX）是在哺乳动物中发现的第二种含硒酶。1982年Ursini等从猪肝脏和心脏中部分分离并描述了一种新的抑制过氧化的蛋白质。1985年分离纯化并确定为含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，因它能特异性地使磷脂氢过氧化物还原，故名磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶[3]。

　　胃肠谷胱甘肽过氧化物酶（GPX-GI）的cDNA是Chu等于1988年从人的肝细胞系克隆到的，并于1993年分离到蛋白质，与cGPX有同源性，是含硒的GPX家族中的第四个同工酶。因它的mRNA只存在于鼠的胃肠道的细胞中，故名GPX-GI[4]。

　　最早把硒和I型碘化甲状腺5’脱碘酶（IDI）联系在一起的是Arthur实验室，他们于1987年报道了缺硒大鼠IDI活性降低。1990年Arhtur和Behne应用双标记技术分别证明了IDI是含硒蛋白。1991年Berry克隆到IDI的cDNA进一步证实了IDI是含硒酶[5]。1995和1996年Galton等克隆了Ⅱ型和Ⅲ型脱碘酶的cDNA，发现了它们的读码框架含有TGA密码子，从而证实它们也是含硒半胱氨酸的含硒酶[6-8]。

　　硒蛋白P是Burk等发现的和Tappel命名的。1987年Burk实验第一次用单克隆抗体分离纯化了大鼠血浆的硒蛋白P。1991年又克隆并测定了硒蛋白P的cDNA。1993年才从人的血浆中分离纯化了人的硒蛋白P[9]。

　　1969年Whanger实验室的Pedersen等在羊的心脏和肌肉细胞中发现一种低分子量（约10Kd）的含硒蛋白质。1984年Whanger将它命名为硒蛋白G并确定硒以硒半胱氨酸（SeCys）的形式存在。因与一组无关的G蛋白同名，故于1992年将它更名为硒蛋白W。1993年从大鼠肌肉中分离纯化了硒蛋白W。1995年克隆到硒蛋白W的cDNA，清楚了所有的氨基酸顺序[10]。

　　在1973-1983年有一系列研究论文指出精子线粒体外膜的形成需要硒。很多学者发现硒存在于线粒体外的一个富含半胱氨酸和脯氨酸的结构蛋白中。1979年Calvin和Cooper将它命名为线粒体外膜蛋白，而1990年Kleene认为命名为线粒体外膜硒蛋白（MCS）似乎更恰当[11]。但是1996年作者本人否定了它是硒蛋白。

　　二、特点及分布

　　（一）特点 9种硒蛋白中的硒都以SeCys形式在于蛋白质多肽中，含硒酶中的硒都位于酶的活性中心。其中cGPX、eGPX和GPX-GI都由4个相同的亚基构成，每个亚基含一个硒原子，三者与PHGPX和IDI的动力学反应都符合乒乓机制。从各种生物分离得到的cGPX分子量为76-92kD。人的eGPX分子量约93kD。比cGPX分子略大些。它的特异活性只有cGPX的10%。与cGPX不同，它是一种糖蛋白。PHGPX是一个单体，含一个原子的硒，分子量约为20kD左右。它的活性被碘乙酸抑制。这种酶有界面性质，即作用于膜和水相之间的界面，是一种膜结合酶，它对卵磷脂过氧化物的活性比对氢过氧化物活性高3.5倍[12]。GPX-GI每个亚基的分子量为22kD，与cGPX和eGPX无交叉免疫原性。IDI是膜结合酶。具有很强的疏水性，分子量约27-29kD，每分子含一个硒原子，它结底物的亲和性为rT3＞＞T4＞T3，对丙基硫氧嘧啶高度敏感[5，13]。IDⅡ和IDⅢ的动力学机制都符合顺序机制，丙基硫氧嘧啶对它们无影响，对底物的亲的性IDⅡ是T4＞rT3，IDⅢ是T3＞T4。硒蛋白P是糖蛋白，分子量约为57kD，由一条多肽链构成，是发现的第一个一条多肽链中含有多个SeCys的硒蛋白。理论上含有10个SeCys实测7.5个，二者差别原因不清。硒蛋白P有富硒区，还富含半胱氨酸（17个）和组氨酸（23个），能与肝素结合。硒蛋白W分子量约10kD，每分子蛋白含一个硒原子。不同生物中硒蛋白W的氨基酸顺序高度同源[10]。

　　（二）分布 各种硒蛋白的分布都有种属和组织特异性。cGPX几乎存在于机体各个组织的所有细胞中，但分布不均一，大鼠肝中cGPX活性比脑中高13倍，羊红细胞cGPX活性高而肝细胞中活性低。cGPX分布于细胞器内由多到少的顺序为胞液、线粒体、细胞核、微粒体[12]。ECPX并不特异性地定位于血浆，还存在于人乳、胆汁、唾液、脑脊液及肾和肺的细胞外液[15]。PHGPX分布于哺乳动物的各种组织，但在大鼠睾丸内活性是肝脏内的2倍；在细胞内以胞核和线粒体内水平最高[12]。GPX-GI位于人胃肠、肝和啮齿类胃肠道的细胞内[4]。IDI主要存在于肝脏、肾脏和甲状腺中，后来发现在垂体和肌肉中有IDI的mRNA位于细胞内质网和线粒体膜上[13，16]。IDⅡ主要存在于大脑、垂体和褐色脂肪组织，最近在人胚的心脏、骨骼肌和胎盘中有它的表达[6、7]。IDⅢ主要存在于中枢神经系统、眼和胎盘中[8]。硒蛋白P存在于血浆中，也存在于肝、肾、心、肺、脑等多种组织的细胞外。近年来报道，与生物膜有联系[13]。硒蛋白W主要位于肌肉细胞的胞液内，其他组织中也有，尚有很少与膜有联系。在羊的心脏细胞液内硒蛋白W和cGPX含硒量相同，在羊中，硒蛋白W在骨骼肌和心脏中含量最高，肝脏中含量最低，而大鼠心脏中缺乏硒蛋白W[10，17]。

　　三、生物功能

　　cGPX是硒蛋白中研究最早功能最清楚的一种。CGPX是体内重要的抗氧化酶之一。它以还原型谷胱甘肽（GSH）作为特异底物，催化还原很多化学上不同种类的氢过氧化物，包括过氧化氢（H2O2）、特丁基氢过氧化物、异丙基氢过氧化物和脂质氢过氧化物，从而能清除组织中有害的过氧化物，保护生物膜和生物大分子结构免受氧化损伤，cGPX的抗氧化功能是硒的很多生物学作用（如抗癌抗衰老等）的生化基础。Sunde（1994）提出cGPX可看作为硒的生物缓冲剂，因为它调节硒参入到GPX和其它硒蛋白之间的量[12]。

　　eGPX的功能不完全清楚。推测它利用GSH作为还原剂，可能作为氧自由基产生的有机氢过氧化物和过氧化物的抗氧化酶[15]。

　　PHGPX还能还原很多种类的过氧化物，但它对过氧化氢的活性较低，对磷脂氢过氧化物的活性较高。它能保护细胞免受氧化型低密度脂蛋白的损伤，对动脉粥样硬化有预防作用[12]。作为抗氧化酶它在某些组织中是非常关键的，尤其是心脏和睾丸。人类克山病的病因有可能与PHGPX在心脏内的功能有关。此外。它还调节白细胞5-脂（肪）氧合酶的活性与白三烯代射有关[12]。

　　GPX-GI和cGPX有相似底物特异性，不能催化磷脂过氧化物还原。在大鼠中以H2O2为底物，分析GPX-GI活性发现它在胃中活性最高，依次是食管、大肠、小肠。在胃肠道细胞内检测不到cGPX的mRNA，这提示在哺乳动物中保护消化道的脂质过氧化毒性损伤中GPX-GI起主要作用[4]。

　　IDⅠ的生理作用是在外周组织中如肝和肾中发挥脱碘作用。把甲状腺素产生的T4转化为有生物活性的T3从而在很多生物过程中发挥重要作用[13]。IDⅡ的作用是垂体、大脑和褐色脂肪组织局部T4脱碘，调节局部组织细胞中的T3水平。IDⅢ只能使T4苯环上5位的碘脱去，使T4转化为rT3。三种脱碘酶的主要作用是维持机体甲状腺激素代谢的动态平衡：一是将低活性形式（T4）转化为活性高的形式（T3）；二是使甲状腺激素降解为活性低或无活性的形式[5-8，13]。

　　硒蛋白P真正的生物学功能还不清楚。一般认为硒蛋白P有运输硒的功能。硒蛋白P含有很多巯基和硒，提示它有很强的还原能力，这与它在血浆中抗自由基或其它反应的活性分子的保护剂一致。Burk等认为硒蛋白P可能参与血红素代射，保护diquat诱导的肝坏死和脂质过氧化，提示它可能是自由基的清除剂[14]。

　　硒蛋白W的功能不清。根据硒以SeCys形式存在，推测可能作为抗氧化剂。它在肌肉中比在其它组织中含量高，提示它在肌肉代谢中可能起重要作用[10]。

　　四、表达和调控

　　基因表达包括DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。真核生物基因的表达受多级调控系统的调节。本文主要阐述硒参入到硒蛋白中的机制和硒对硒蛋白合成的调节作用。在硒的生物化学领域中一个惊人的新进展是发现硒蛋白mRNA中的终止密码子UGA指导硒半胱氨酸（SeCys）共价插入。应用这一特殊密码子特异插入SeCys，提示SeCys在核糖体蛋白质合成方面可以看成是第21种氨基酸，UGA被定为SeCys的遗传密码。这个发现明确了硒直接参与硒蛋白的翻译过程而不是翻译后参入。

　　真核生物SeCys的合成和插入是受转运SeCys的Trna（SeCys-tRNAsce）调节的与翻译同时进行的过程。SeCys的碳链骨架来自于丝氨酸，有两种具有独特的二级和三级结构的抑制性tRNA（tRNAsec）连接丝氨酸和UGA密码子。

　　硒蛋白的合成是一个复杂的过程。原核生物中硒蛋白的合成过程已清楚。在原核生物中，SeCys的合成和参入需要有mRNA开放阅读框架中的一个UGA密码、UGA下游紧接的具有特异顺序的茎环结构、4种独特的基因（SELA、SELB、SELC、SELD）产物和携带有UGA反密码子的tRNAsec。SELD基因产物是磷酸硒激酶它能催化ATP和硒化物生成磷酸硒。SELC基因的产物的丝氨酰-tRNA合成酶，催化作为SeCys骨架来源的丝氨酸酯化成独特的tRNAsec。SELA基因产物是硒半胱氨酸合成酶，催化L-丝氨酸的痉基脱去而换上Se生成SeCys。SELB基因产物类似于延长因子EF-Tu。它与GTP结合形成mRNA-SELB-GTP-SeCys-RNAsec复合物，使SeCys插入到肽链中UGA所在的特殊位置而形成硒蛋白[12，14]。

　　真核生物硒蛋白的合成与原核生物中硒蛋白的合成有类似之处，但要复杂得多且某些细节还不清楚。真核生物所有硒蛋白的基因都包括5’端非翻译区（5'-UTR）、含TGA读码框架的外显因子、内含子和3'端非翻译区（3'-UTR）。SeCys-tRNAsec识别正确的UGA而不是作为终止密码的UGA需要Mrna3'-UTR的特殊结构顺序，即SeCys插入顺序（SECIS）。它包括稳定的环结构和茎环上特定的核苷酸顺序。Berry[13]等发现IDⅠmRNA的3’-UTR的200个碱基中有SeCys插入必需的茎环节结构，cGPXmRNA的3'-UTR也有类似的茎环结构，硒蛋白P mRNA的3'-UTR有2个茎环结构，它们都有共同的保守顺序，即环上的AAA、茎5’端非配对的UGAU和3’端非配对的GAU。环上AAA是SECIS中发挥最佳功能所必需的，茎上非配对的保守核酸是SECIS发挥最佳功能关键。到目前为止，已测序的所有哺乳动物硒蛋白mRNA的3'-UTR预测都包含稳定茎环节结构，它可能抑制释放因子在UGA密码子和核糖体作用而抑制翻译结束。另外，SECIS中茎环结构的二级构特点对SeCys插入也是重要的，但密码子UGA周围顺序和茎环位置与SeCys插入关系不大。核糖体结合实验显示通常的延长因子不能识别SeCys-tRNAsec和UGA作用，需要有特殊的延长因子，但这种延长因子在真核细胞中还未分离到。

　　哺乳动物基因有个调控区调节硒蛋白的表达。潜在的转录调节位于5’-UTR、3’-UTR和/或内含子。在mRNA相同的位置的同一密码既可编码SeCys又可作为终止密码，这受3’UTR的SECIS及其多聚腺苷酸的调节。且多聚腺苷酸还调节mRNA的稳定性。

　　硒蛋白基因的表达受硒营养状况的影响。研究表明硒不影响基因转录，即mRNA的生成量，便它影响mRNA的稳定性，PHGPX mRNA例外，它受硒的影响较少[18]。硒缺乏时硒蛋白mRNA稳定性降低，mRNA水平降低，硒过多时mRNA 水平不升高。翻译水平的调节为硒影响SeCy-tRNAsec的合成和tRNAsec反密码子的甲基化。膳食硒充足的大鼠比缺硒者总SeCys–tRNAsec量高，tRNAsec反密码子摇摆位置甲基化增加使tRNASsec处于更开放更稳定时构型。硒缺乏时，所有硒蛋白合成都降低，但各种蛋白对缺硒的敏感性和降低的程度不同，其中cGPX最敏感，降低幅度最大，这主要取决于各种硒蛋白mRNA的稳定性不同，硒调节mRNA稳定性的机制还不清楚[19]。

　　硒蛋白合成还受其它因素的影响，如动物种属和组织差异的影响。CGPX基因表达还受铁的影响，缺铁导致cGPX mrnat 蛋白质的量及酶活性都降低[20]，cGPX受硒的调节在甲状腺与肝和肾中不同，在甲状腺中，碘对它的影响比硒大[16]。IDⅠ除受硒影响外，还受甲状腺机能状态的影响，甲状腺功能亢进时IDⅠ mRNA及酶活性都升高，甲状腺功能减退时都降低。

　　近年来，哺乳动物硒蛋白的研究突飞猛进，但仍有很多未解决的问题，尤其是硒蛋白基因表达非常复杂，且受多种因素影响，许多问题有待于进一步研究。

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