链置换扩增术（SDA）及其进展

发布：www.liulingling.com　来源：医学杂志

　　摘要链置换扩增术（strand displacement amplification,SDA）是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3'端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。本文主要介绍SDA的原理及其发展。

　　关键词链置换扩增术；DNA检测

　　近几年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸（DNA或RNA）检测的诊断方法（如各种PCR、Southern杂交和Northern 杂交）已大量建立并获得广泛应用。这给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。虽然这些方法在临床实践中也遇到一些问题，如PCR的假阳性与假阴性问题，但基因诊断具有一些特殊优点，如：需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛；因此，众多学者学者不断改进现有技术探索新方法。新技术如转录依赖的扩增系统（TAS）、自主序列复制（3SR）、循环探针反应、Qβ复制酶扩增法、快速导流杂交法、DNA凝集反应等陆续出现。SDA就是在这样的背景下产生发展起来的，与其它的DNA扩增技术相比，SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。

　　1992年，美国Becton Dickinson研究中心的Walker等发表了关于SDA的研究报道，标志一种新的DNA扩增技术SDA的诞生[1]。人们也在不断对SDA进行改良。用BsoBⅠ代替HincⅡ和采用exo-Bca酶代替exo-Klenow酶建立了嗜热SDA（thermophilic sDA），并以荧光偏振（Fluorescence Polarization,FP）检测技术代替电泳法作为SDA产物检测方法，使SDA检测更快速、灵敏且可定量。

　　2 SDA的原理

　　SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术[1]。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。

　　SDA中所用核酸内切酶的切割位点需专一，对识别位点的化学修饰敏感且在打开缺口后能立即解离让位于DNA聚合酶，如HincⅡ、HindⅡ；所用DNA聚合酶有链置换生活，但没有核酸外切酶活性（如cxo-Klenow）。因为3'→5'外切酶活性会使引物单链在反应中降解；5'→3'外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的5'悬端水解。DNA聚合酶需满足如下条件才能用于SDA反应：①无外切核酸酶活性；②于缺口处启动反应；③可利用dNTPas;④具有链置换活性。以上两种酶最好是耐热毒，如BsobⅠ和exo-Bca酶，以便提高SDA反应的温度以缩短反应时间、提高反应效率和提高SDA的特异性。应用BsoBⅠ和exo-Bca酶的SDA称嗜热SDA，能于20分钟内将靶DNA扩增1010倍，所用dNTP中有一种是经化学修饰的核苷酸（如dCTPas）一根据所用核酸内切酶的不同而不同。采用修饰核苷酸的目的是在SDA中形成修饰的核酸内切酶识别位点，使核酸内切酶不能切断双链DNA而只将其打开缺口。所用两对引物（B1，B2与S1，S2）中有一对（B1，B2）只含与靶片段互补的序列，而另一对（S1，S2）除含与靶片段互补的序列外，还在其5'端含所用核酸内切酶的识别序列（如BsoBⅠ的识别序列为5'-TCGGG），且S1（S2）在模板上的结合位点位于模板上B1（B2）结合位点的5'侧。

　　2.1制备单链DNA模板用热解链法制备单链DNA模板可避免影响SDA体系的pH。其它制备方法如酶解链法未见报道。该阶段实际上只是在为SDA准备模板。

　　2.2两端带酶切位点的目的DNA片段的生成该阶段通过3次引物延伸和2次置换反应，以单链DNA为模板制备两端酶切位点的双链DNA片段。B1（B2）与S1（S2）分别结合在模板上相应结合位点并在DNA聚合酶作用下延伸其3'端；在B1（B2）延伸的同时，将由S1（S2）延伸所形成的链置换下来；置换下来的链（T1）的5'端含S1（S2）序列，继续参与反应：而B1（B2）与原始模板形成的双链则不再参与反应。T1含B2（B1）和S2（S1）的互补序列，与B2（B1）、S2（S1）结合并经特定DNA聚合酶的延伸和替换，获得一条5'端S2（S1）序列且3'端含S1（S2）互补序列的单链DNA（T2）。B2（B1）与T1形成的双链亦不再参与反应。T2再与S1（S2）结合并被DNA聚合酶延伸，从而形成两端均带有特定限制性核酸内切酶识别序列的双链DNA。该阶段无放大作用，是等摩尔反应。

　　2.3SDA循环在此阶段，靶序列才被迅速放大。限制性核酸内切酶在其识别位点S1（S2）处将双链DNA打开缺口，DNA聚合酶延伸该切口的3'残端并替换下一条5'端含部分S1（S2）序列、3'端含S2（S1）互补序列的单链DNA（T3）。T3与S2（S1）结合并引导延伸而形成一条一端含S2（S1）序列、另一端含部分S1（S2）序列的双链DNA。核酸内切酶又可在其识别位点S2（S1）处将双链DNA打开缺口并通过DNA聚合酶的延伸和替换而获得一条5'端含部分S2（S1）序列3'端含部分S1（S2）互补序列的单链DNA（T4）。T4部分S1（S2）互补序列，可与S1（S2）结合，DNA聚合酶延伸T4-S1（S2）复合物的两个3'残端而形成一条一端含S1（S2）序列，另一端含部分S2（S1）序列的双链DNA。限制性核酸内切酶的切割、DNA聚合酶的延伸和替换、引物的延伸。如经反复进行，使SDA构成循环反应。

　　在DNA聚合酶延伸、替换生成单链的同时亦生成一条双链的DNA。该双链DNA可再被切割、延伸替换，并又有同一双链生成，从而构成SDA的双链循环。由于在SDA中单、双链都不断循环，故靶片段得以高效扩增。

　　3 DNA的研究进展

　　Walker等将由HincⅡ、exo-Klenow酶所组成的SDA系统用于扩增结核分枝杆菌IS6110 dNA片段，在37℃孵育2h，获得108倍扩增。1994年，Walker等在原单靶SDA（只对一靶片段进行扩增的SDA）的基础上将SDA的扩增序列拓展为两个，即建立了复合SDA(Multiplex sDA)[2]。Walker等使用由HincⅡ和exo-Klenow酶所组成的复合SDA系统（40℃孵育2h）成功地使结核菌IS6110和分枝菌16S dNA片段都获得108倍扩增[2]。之后，Walter,Zwadyk,Little等对SDA的引物特异性等与PCR作了比较[3-7]。但并没使SDA技术本身有多在发展。1996年SDA发展最迅速的一年，无论是SDA系统还是SDA产物检测方法都有较大革新。

　　3.1SDA产物检测方法的进展 Walker等将荧光技术引入SDA产生检测，建立了SDA的荧光偏振（Fluorescence polarization，FP）检测手段[4]；该技术解决了用电泳检测SDA产物的拖尾问题，比电泳法更灵敏、快速且能定量。在SDA和FP检测技术中，一种5'端标记有荧光素的寡核苷酸探针被加入到SDA产物中，该荧光探针本身只有很弱的荧光效应，而一旦与相应互补序列形成双链，荧光效应就会大大增强。因此，通过检测荧光强度的增加就可得出SDA产物中靶DNA的含量。当加入一种DNA结合蛋白（如只有结合活性而无切割活性的EcoRⅠ），可使该法获得更满意的效果[8，9]。1997年Spears等将荧光探针加入到SDA循环中，建立了同步SDA荧光偏振检测技术（simutaneous sDA and FP detection）[10]，用于检测沙眼衣原体获得成功。之后，FP就成为SDA产物检测的主导方法。也可通过DNA聚合酶延伸同位素标记的探针来检测。

　　3.2SDA系统的改进 Spargo等于1996年报道用BsobⅠ代替HincⅡ，用缺乏5'→3'核酸外切酶活性的exo-Bca酶代替exo-Klenow酶组成嗜热SDA（therm ophilic SDA）系统[11]，将反应温度提高到60℃而时间则缩短到15min，且扩增效率提高100倍，而且使SDA产物更加专一，非特异扩增降低[11]。将嗜热SDA与FP结合的DNA检测技术能在30min内检测出极低含量的靶DNA，使SDA成为极具应用前景的核酸检测技术。

　　在SDA的临床应用方面，Down等和Ichiyama等人进行了一些有益的探索。Down等采用化学发光的方法对294例临床收集的痰标本进行了TBIS6110的检验，并根据校正曲线换算成相应的结核杆菌数目[12]。他们得出的初步结论是SDA可用于临床标本的结核杆菌检测。Ichiyama等人做了SDA与PCR和培养法检测结核杆功物临床对比实验[13]在用SDA、PCR和培养法对299位病人的530例痰标本进行结核杆菌检验的实验中，以细菌培养法作参考，SDA灵敏度为94.7%，PCR的灵敏度为89.5%，PCR的特异性为100%。Ichiyama等据此认为，在临床上检测痰标本中的结核杆菌方面，SDA应当是一种很有用的方法。

　　4 SDA的不足

　　一是SDA产物不均一。由于在SDA循环中总要产生一些不同的单、双链产物，这使得用电泳法检测SDA扩增产物时必然要出现拖尾现象。尽管有不少学者试图通过调节钙、镁离子浓度以及酶的用量来改善[7]，但由于这是SDA的必然产物，目前的技术不可能根本消除。二是SDA产物的两端必然带有所用核酸内切酶的识别序列或其残端，因而SDA产物不可能直接用于克隆。这使得SDA在基因工程方面没有优势。三是目前SDA产物的检测手段尚不够如意。目前SDA产物检测的主导方法是荧光偏振检测法。但该检测方法需要特殊仪器——荧光分光光度计，这限制了SDA在临床的广泛应用。另外，SDA可能因标本中含有不明抑制物，使检测不能反映标本中靶DNA的真实含量。复合DNA中高含量靶DNA对低含量靶DNA的竟争抑制现象也很常见。

　　5 SDA的应用前景

　　如前所述，对SDA检测技术的研究已有取得可喜的成绩。嗜热SDA的建立并与FP结合，使高灵敏度、快速特异的SDA检测成为现实。最近，Mehrpouyan等人用SDA检测HIV-1 rNA获得成功[14]，这说明SDA可用于所有核酸的检测。总之，虽然SDA尚有不如人意的地方，但随着其不断迅速发展，可以相信，SDA将成为临床疾病的诊治和科学研究的有用手段。

参考文献

　　1 Walker GT,Fraiser MS,Schram JL,et al.Nucleic Acids res,1992;20(7):1691-6

　　2 Walker GT,Nadeau JG,Spears PA,et al.Nucleic Acids res,1994;22(13):2670-7

　　3 Walker GT,Nadeau JG,Linn CP,et al.Clin Chem,1996;42(1):9-13

　　4 Walker GT,Nadeau JG amd Linn CP.Mol cell-Probes,1995;9(6)399-403

　　5 Walter NG.J Mol Biol,1995;254(5):856-68

　　6 Little MC,Sears PA and Shank DD.Mol Cell probes,1994;8(5)375-84

　　7 Zwadyk P Jr,Down JA,Myers N,et al.J Clin microbiol,1994;32(9)2140-6

　　8 Walker GT,Linn CP and Nadeau JG.Nucleic Acids res,1996;24(2)348-53

　　9 Walkdr GT and Linn CP.Clin Chem,1996;42(10):1604-8

　　10 Spears PA,Linn CP,Woodard DL,et al.Anal biochem,1997;247(1):130-7

　　11 Spargo CA,Fraiser MS,Van Cleve M,et al.Mol Cell probes,1996;10(4):247-56