酵母双杂交体系的新发展

　　摘要 酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的一种有效方法。本文简要介绍了双杂交体系的原理、应用和自身存在的问题，并对其最新发展做了重点阐述。

　　关键词 酵母双杂交系统，蛋白质一蛋白质间相互作用

　　自从Fields和Song[1]首先描述了酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system），这一研究蛋白质间相互作用的新技术已经得到了广泛的应用。它的可行性、有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的候选蛋白的研究中已被证实并被推广到了诸如细胞周期调控、信号传导、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。随着日益广泛的应用，人们也不断地对这一技术进行了完善和发展。

　　一、酵母双杂交体系的原理及应用

　　真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域（binding domain,BD）和转录活化结构域（activation domain,AD）共同完成的[2]，这两个结构域通过共价或厞共介连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键[3，4]。根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。

　　迄今为止，应用于筛选基因的双杂交体系已发展出很多版本。以较早发展起来的Y190为例，它采用了GAL1-HIS3，GAL1-LacZ双重报告基因，其中启动子GAL1由包含转录因子Ga14的BD特异识别位点的上游激活序列UAS和基础启动子（minimai promoter）组成。营养筛选适于作为初筛处理大理筛查对象；颜色筛选则是对杂合蛋白复合体转录激活功能的再验证，易于排除部分假阳性。在酵母Y190中，由于HIS3基因的TATA盒中具有不受GAL1上游激活序列调控的低水平启动转录功能，就使得通过颜色进行再次筛选尤为重要。用于双杂交筛选的表达质粒载体如Ga14系列除能表达BD或AD与“诱饵X”或“猎物Y”融合的杂合蛋白外，还在该杂合蛋白的N端添加了SV40的核定序列（nuclear localization sequence），使该内的蛋白量可以满足检测的灵敏度需量。经验证明，应用不同体系进行检测的灵敏差异主要取决于控制报告基因表达的启动子和DNA结合序列的特点以及两种融合蛋白在酵母中的表达量[11]。

　　作为一种高度敏感[5]、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白质在体研究体系，双杂交系统主要应用于：①验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用；②确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸；③筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质。由于具有相对简便、快速及不经蛋白质纯化即可相接获得编码基因的特点，采用双杂交体系从cDNA文库和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用成为它最具优势之处。由此而鉴定的各种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控、肿瘤发生的蛋白质已不胜枚举[6-10]。

　　二、双杂交系统的缺陷

　　尽管已被证实为一种非常有效的方法，双杂交系统也有自身的一些问题和缺点：首先，它并非对所有蛋白质适用。由其原理所决定，融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但傜不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛查结果[12]。其次，假阳性的发生较为繁多，在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型[3]：Ⅰ型：表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录。Ⅱ型：表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录。Ⅲ型：表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。这其中部分假阳性来源于筛选对象具有类似转录因子的功能，或在双杂交体系中能表现出这种特性。再次，部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖[14]。还应意识到的一点是，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用，但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的。因此，对于筛选对象和范围，应有一个合适的选择。

　　三、酵母双杂交体系的新发展

　　在双杂交的具体操作中，虽然筛选本身较为简便，但由于该体系存在一些自身问题，使得筛选的结果往往会出现几十、几百甚至更多的阳性克隆，后续的分类、鉴别工作直至找到具有意义的基因片段需耗费大量的时间及精力。近年来，双杂交系统的广泛应用促进了该系统的不断改进与提高。主要体现在：

　　1.发展了酵母菌株的多重筛选机制。位于报告基因上游的启动子是决定报告基因表达灵敏性和特异性最重要的因素，较早的双杂交系统虽然采用了双重报告基因，如HIS3和LacZ，但它们是受同一启动子GAL1的调控，具有相同的17个碱基的BD识别序列，能激活其中之一者很有可能在另一检测中亦呈阳性。目前设计的酵母菌株往往具有不同启动子调控下的报告基因。如PJ69-4A[14]具有三个报告基因：GAL1-HIS3、GAL2-ADE2和GAL7-LacZ，GAL1、GAL2、GAL7都有可被Ga14BD识别的特异序列，且特此之间各不相同，使三种报告基因能同时产生假阳性反应的机率明显下降。其中GAL2-ADE2，经对照实验检测为一种灵敏性、特异性均强的报告基因，清除假阳性很有效。

　　2.表达型载体的构建也正进行着几方面的改进。首先，融合蛋白被置于一些可被诱导的启动子调控之下，使蛋白质在酵母的表达量能依需要进行调控[15]。其次，BD或AD与作用蛋白质的连接方式也不再只是BD或AD与作用蛋白质的连接方式也不再只是BD或AD的C端与蛋白质的N端，因为蛋白质的N端和其活性也有很大关系，对于常规连接找不到作用蛋白的对象，改用N端也许能有不同的发现[11]。双杂交体系中不同载体原来均采用氨苄抗性作为选择标志，现在可被改进成具有耐氨苄、卡那霉素或氯霉素等不同耐药基因的载体[16]，使得原来繁琐的从酵母中提取出单一质粒的工作变得轻松快捷。

　　3.用于双杂交筛选的文库不但应有代表每一基因的足够丰富的多样性，而且由于蛋白质间发生作用的位点可能为蛋白质多肽链的任意位置，所以对每一基因而言，还应当提供尽可能多地与AD连接位点[14]。插入片段不易过大，否则因为非特异结合所导致的假阳性也会明显增多。选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的文库是综合提高双杂交技术的一个重要方面。

　　4.邻近存在的两个不同交配型的酵母配子体可能交配形成二倍体。利用这一特点，酵母交配（yeast mating）可以很方便地将两种不同的质粒转入同一酵母菌株[17]。目前此方法已成为酵母转化的主要替代方法，极大的提高了可以被同时检测的蛋白质数量。据此已发展出一套快速鉴定假阳性的方法[6]。

　　5.体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验证，为了使后续的采用其他方法再次鉴别蛋白质相互作用的步骤更易实施，有报道将双杂交筛出的基因片段插入一个带有抗原决定簇标记的质粒载体，该载体可在哺乳动物细胞中高水平表达被抗原决定簇所标记的蛋白质。用BD-X质粒和带有AD-Y插入的抗原决定簇质粒载体共转染哺乳动物细胞，即可直接进行免疫共沉淀检测。应用这一方法已证实了Bcl-XL和Bad/Bax之间的相互作用[19]。

　　6.除了在酵母中应用外，双杂交体系也已扩展到哺乳动物细胞[20]。因为有一个更类似于生理环境的蛋白质合成、加工及反应体系，有利于发现起初的蛋白质间相互作用。该体系除了构建表达载体外，还需要构建一个可被调控的报告基因载体共同转染细胞。氯霉素乙酰素转移酶（Chloramphenicol acetyltransferase）活力检测，细胞表面标记分子CD4和Hygromycin抗性均可作为报告基因来反映蛋白间作用的有无与强弱[20，21]。

　　综合利用以上改进来构建一种更准确、更有效、更可行的双杂交体系及配套方法，将会为双杂交体系研究蛋白质间作用提示一个美好前景。

　　四、结语

　　正如人类基因组计划曾给生物学家带来巨大希望一样，应用迅速发展的双杂交体系去逐渐架构生物体系中纷繁复杂的蛋白质间联系，为我们展示了一个获得大量的生物学信息的新途径。尽管对于此方法还有许多不同的认识，而且目前尚不能完全正确地估价这些信息的价值，但它毕竟使生物科学在实现将结构与功能最终结合为一体这个目标上又向前迈进了一步。随着酵母杂交体系的不断完善和提高，以及在应用及处理结果方面经验的不断积累，相信基于双杂交原理而建立的一系列方法将会为生命科学的进展起到积极的推动作用。

参考文献

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