类风湿关节炎滑膜细胞酪氨酸激酶信号传导系统

　　多细胞生物中，细胞的生长分裂受到相邻组织甚至生物整体的调节控制。细胞怎样将外界刺激信号传递到细胞核内，一直是人们十分关心并不断探索的问题．生长因子则是实现这种调节的生物信号之一，其受体则是把信号介导到细胞内，引起细胞内酪氨酸激酶磷酸化，使信号向下游传导，调控核内相关基因的开放或关闭，最终导致DNA合成和细胞分裂的关键成分。另外，许多癌基因蛋白是生长因子或其受体或细胞内重要激酶的类似物，以某种方式干扰和破坏了细胞的正常分裂信号通路，引起信号的持续传导，细胞出现过度增生，以致癌变。

　　1　类风湿关节炎的类肿瘤样特征与酪氨酸激酶的相关性

　　类风湿关节炎(RA)典型的病理特征为炎症滑膜增生、单核细胞浸润和新生血管形成。生长特性类似于局限性侵袭性生长的肿瘤，不表现为接触抑制，侵蚀邻近关节软骨和骨组织。滑膜细胞核大，苍白，核仁明显，体外培养能够在无锚依赖条件下生长，形成细胞集落；长期培养失去这些特性，但加入特异外源性的细胞因子又可恢复〔1〕。说明类风湿关节炎的发生与滑膜以自分泌和/或旁分泌的方式产生大量的细胞因子是密切相关的。IL-1或TNF-α刺激滑膜细胞分泌大量的胶原酶和前列腺素E2(PCE2)，介导关节软骨和骨的破坏，体外培养滑膜细胞用血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)刺激时滑膜细胞出现典型的无锚依赖和集落生长的特性，而用IL-1或TNF-α刺激时不出现〔2〕。

　　RA滑膜细胞的过度增殖被认为是癌基因过度表达和/或抗癌基因表达低下。细胞癌基因产物是上述生长因子和受体的类似物，多类癌基因产物作用于细胞信号传导的不同途径，导致持续的信号传导。如膜相关癌基因产物sis是PDGF的类似物，能刺激PDGF的受体；胞浆内ras是GTP结合蛋白，可以将信号由胞膜传递至细胞内激酶；细胞原癌基因myc、myb、fos、jun等编码的核内蛋白能结合DNA的启动子，调节相关基因的转录等〔3〕。

　　许多生长因子受体本身具有酪氨酸激酶活性，如血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、胰岛素受体(IR)、类胰岛素受体(IGR)及粒细胞刺激因子(CFSR)等〔3～6〕。酪氨酸激酶活性可能是生长因子受体的基本属性，其激活是生长因子

　　信息传递的关键步骤，在细胞生长、增殖、转化中具有重要的作用。逆转录病毒产物neu、v-fms、v-kit等与受体酪氨酸激酶结构有相似之处，引起转染细胞过度的信号传导，这只是肿瘤发生的一个方面，主要的是肿瘤细胞以自分泌的方式产生过量的配体及过度表达酪氨酸激酶受体〔4〕。同样RA滑膜中存在过量的细胞因子和与其有同源性的癌基因产物，其发生可能与肿瘤有许多相似之处〔3，7，8〕。现在生长因子受体酪氨酸激酶引起了人们广泛的兴趣，通过对受体酪氨酸激酶的研究将有利于阐明RA的发病机制。

　　2　酪氨酸激酶的结构、分类及功能

　　酪氨酸激酶(TK)是一类催化ATP之γ-磷酸转移到蛋白质酪氨酸残基上的激酶，能催化多种 底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化。至目前为止，至少有50个以上的受体酪氨酸激酶(RTK)得到鉴定，它们分属于13个不同的受体家族。为了理解RTK怎样调节细胞内的信号传导，我们需要首先了解其结构及其是如何发挥功能的。

　　所有的RTK均含有一个糖基化的细胞外配体结合区，一个穿膜区和保守的胞内活性区〔3～5〕。

　　2.1　胞外区由500～850个氨基酸组成亲水性的配体结合区，糖基化位点大都在此区。

　　2.2　跨膜区高度疏水，缺乏带电荷的氨基酸残基，长度保守(22～26个氨基酸)，但氨基酸序列并不保守；单跨膜区域使RTK明显不同于七跨膜受体，如β-肾上腺素能受体等。酪氨酸激酶的单跨膜区在信号传导中没有直接的作用。

　　2.3　胞内区由500～600个氨基酸组成，胞内区负责产生信号传导，其分子机制并不完全清楚。包括胞内分子的一系列变构激活和与蛋白底物及调节因子如蛋白激酶C(PKC)的相互作用。

　　2.3.1　近膜区(juxtamembrane)是由41～50个氨基酸组成，将酪氨酸激酶区与胞膜分开，四种RTK的近膜区氨基酸序列各不相同，但每一类型RTK近膜区的氨基酸序列高度保守，如EGF受体该区的苏氨酸(Thr654)是PKC的磷酸化位点，对信号传导有调节作用。

　　2.3.2　激酶区氨基酸序列高度保守，包括ATP结合位点、底物结合区、自身磷酸化位点和调节位点。完整的激酶区是RTK介导信号传导所必需的。

　　2.3.3　羧基末端(C-tail)由70～200个氨基酸组成，一级结构在不同种属间不同，甚至在同一类型的RTK种亦不相同。该区富含分子量小的氨基酸，构成亲水性强的多肽链，赋予羧基末端极大的柔韧性。此区酪氨酸激酶的磷酸化可能对激酶区的活性有上调或下调作用。该区有EGF(酪氨酸1068，1148和1173)及IR(酪氨酸1316，1332)的自身磷酸化位点。

　　RTK分为4种类型：Ⅰ型的显著特征为胞外区具有富含半胱氨酸的两个重复序列。包括EGFR、HER2/neu、HER3/c-erb-3和Xmrk。Ⅱ型为异四聚体结构，各2个α及β亚单位由二硫键相连。α亚单位含一富含半胱氨酸的重复序列，构成配体结合区；β亚单位穿膜后与酪氨酸激酶区相连。包括IR、IGFR。Ⅰ、Ⅱ型富含半胱氨酸的重复序列构成坚固的能抵抗蛋白酶消化的构型。Ⅲ型没有胞外区富含半胱氨酸的重复序列，由5个免疫球蛋白(Ig)样结构组成。RTK激酶区有一77～107个亲水性氨基酸构成的插入序列(KI)将ATP结合位点与底物受磷酸位点分开；Ⅲ型包括PDGFR和v-fms/c-kit。Ⅳ型结构同Ⅲ型类似，仅胞外区是由3个Ig样结构组成。包括FGFR、flg和bek。四种RTK结构上的相似性说明它们可能是源于同一受体结构不断进化的结果，从而提示它们在信号传导途径及调节机制方面有共同之处，但它们引起的最终细胞生物效应各不相同。

　　3　酪氨酸激酶的信号传导途径〔3～9〕

　　目前该类受体介导的信号传导的全过程，特别是其下游通路还未完全阐明，对PDGFR及EGFR的研究表明，作为RTK的靶蛋白及参与受体后信息传导的细胞内蛋白，尽管功能各异，但几乎都具有1～2个src癌基因家族同源区SH2或SH3结构，其功能是介导RTK及其靶蛋白以及细胞内信号传导蛋白间的相互识别及结合作用。未与配体结合的受体在膜上多以无活性的单体形式存在，生长因子与其结合后，可诱导受体膜外区的构象改变，形成活性受体二聚体，并使细胞内的酶活性区激活，该酶激活的确切机制还不清楚，受体的二聚体化被认为是先决条件。激活的RTK先使受体自身的Tyr磷酸化，导致该酶活性进一步增强，继而催化其靶蛋白上Tyr的磷酸化。

　　3.1　激活磷脂酶Cγ(PLC-γ)，该酶可使磷酸肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)分解为被称之为第二信使的甘油二酯(DAG)及三磷酸肌醇(IP3)。前者可活化PKC，继而通过它对许多蛋白和酶的修饰，调节一系列生理过程；后者能通过与内质网上的IP3受体结合，导致Ca2＋的释放，从而启动细胞内Ca2＋信号系统，以调节另一系列生理过程。由于作为RTK底物的PIP2可通过与一种肌动蛋白结合蛋白—profilin结合，调节肌动蛋白的解聚，因此，RTK型受体与细胞骨架蛋白的调节系统亦有关。

　　3.2　激活磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)，该酶由85 000及110 000两个亚单位组成的异二聚体，前者为调节亚单位，含有2个SH2区及1个SH3区，SH2区介导该酶与受体的结合；后者为催化亚单位，可使磷脂酰肌醇(PI)中肌醇环上的3位羟基磷酸化，从而逐步形成PIP3。该条通路可能是不同于PLC-γ-磷脂酰肌醇通路的另一条信号传导通路。

　　3.3　ras功能的调节，受体中的pTyr还能与p21GAP(G蛋白激活蛋白)中的SH2区结合，并使rasGAP中的Tyr磷酸化，磷酸化后GAP的活性降低，致使rasGTPase活性下降，其结果使p21ras结合GTP水平增高而处于激活状态。活化的p21ras进而触发一连串丝/苏氨酸激酶的连锁反应，相继激活Raf-1激酶、有丝分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)等。

　　3.4　src家族成员的活化，RTK还能激活细胞内非受体型的蛋白酪氨酸激酶(PTK)，如src家族成员的活化，活化的src家族成员又可激活Raf-1K介导的细胞内信号传导通路。

　　胞内信号传导分子经磷酸化的瀑布反应，将信号逐级放大，最终将其传到核内的转录机构，以调节特定基因的表达，如c-fos、c-jun等，或通过改变细胞内蛋白质的功能状况，如骨架蛋白的磷酸化等，导致细胞的增殖和分化。此外，该型受体还有多个苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)的磷酸化位点，这些位点是细胞内PKC或其他丝/苏氨酸蛋白激酶的底物，这些部位的磷酸化常降低受体与配体结合的亲和力，并抑制RTK的活性及信号传导通路中激酶的活性。

　　4　类风湿关节炎中酪氨酸激酶信号传导的研究

　　RA中详细的细胞信号传导途径现在尚不完全清楚，虽然不同的刺激因子所引起的信号传导通路可能不完全相同，但生长因子受体酪氨酸激酶激活被认为是首要条件〔3〕。

　　Reamers等〔10〕1991年报道RA患者滑膜细胞酪氨酸激酶活性及原癌基因c-fos和c-myc的表达显著高于骨性关节炎(OA)患者；酪氨酸激酶的抗体及酪氨酸激酶抑制剂能显著减轻RA关节炎的程度〔3〕。在RA中研究较为深入的为PDGF、EGF、FGF。

　　PDGF由滑膜组织产生，刺激滑膜细胞无锚依赖生长并形成细胞集落〔1〕。Kypta等〔11〕1990年实验证实PDGF能激活src家族，如PP60src、 P59fyn和PP62yes。Sano等〔8〕1993年用免疫组化证明PDGF、磷酸化酪氨酸及FGF在滑膜组织中同时表达，并且高水平的磷酸化酪氨酸与炎症活动性成正相关。1996年Migita等〔12〕用PDGF刺激体外培养的滑膜细胞能迅速引起酪氨酸磷酸化和激活MAPK、70 000-S6激酶(P70s6k和90 000-S6激酶(P90rsk)。大环内酯类rapamycin能完全抑制体外培养滑膜细胞的生长和P70s6k的激活，而对酪氨酸磷酸化、MAPK及P90rsk的激活并不受影响。P90rsk是MAPK的下游底物，它的激酶活性受MAPK的调节，P70s6k和MAP激酶/P90rsk在PDGF刺激的信号传导中是两个不同的途径。说明生长因子介导的S6激酶之一P70s6k与滑膜细胞的生长密切相关。PDGF通过S6激酶的信号传导途径最终诱导能刺激滑膜细胞增殖和加重关节破坏的原癌基因c-fos和c-myc mRNA的过度表达。

　　EGF是53个氨基酸组成的多肽，能诱导滑膜细胞和血管的增生〔7〕。Shiozama等〔7〕1989年用免疫组化的方法证明RA滑膜衬里层细胞EGF的表达量同衬里层的厚度及新生血管的程度成正相关，明显高于OA及创伤性关节炎，但EGF的表达量同单核细胞浸润的程度无明显相关性。电镜检查EGF定位于B型滑膜细胞的粗面内质网及高尔基体和A型细胞的表面，提示B型细胞能激活A型细胞。

　　b-FGF由146个氨基酸构成，分于量为18 000，Melnyk等〔13〕1990年在体外培养的滑膜细胞上清中检测出b-FGF。Nakashima等〔14〕1994年证明FGF以自分泌和/或旁分泌的方式刺激RA滑膜增生和新生血管形成，在RA中的表达量同炎症的活动性成正相关，在OA滑膜中几乎不表达。RTK的激活是b-FGF刺激滑膜细胞信号传导的先决条件，虽然在其他细胞系中，已确定其下游信号传导需P21ras、PKC和丝/苏氨酸蛋白激酶，但在滑膜细胞中RTK激活后的下游信号传导途径尚不完全清楚。1995年Migita体外培养滑膜细胞，用herbimycin和染料木素能完全抑制b-FGF诱导的滑膜细胞增生，而PKC抑制剂HT不能抑制滑膜细胞的增生。作者认为b-FGF诱导的滑膜细胞增生依赖于RTK及MAPK的激活，而MAPK的激活并不依赖PKC；ras、raf及MAPK激酶(MAPKK)的激活可能是MAPK激活的重要途径。

　　TGF-β是25 000的生长因子，对滑膜细胞的作用报道不一，Lafyatis等〔1〕1989实验证明它能抑制滑膜细胞的增殖；但亦有相反的报告〔15〕，Kawakami等〔16〕1996年实验证实TGF-β能抑制抗Fas抗体诱导的滑膜细胞凋亡，未找到TGF-β相应的酪氨酸激酶受体，推测可能是通过EGFR发挥作用〔3〕。

　　类胰岛素生长因子(IGF)能刺激软骨细胞蛋白多糖的合成。RA中软骨基质降解增加，软骨细胞蛋白多糖的合成受到抑制，提示IGF在RA中调节紊乱〔3〕。

　　5　总结

　　RA是一种严重影响人类健康的疾病，尽管现在对于其发病机制的认识取得了令人瞩目的进展，然而RA的治疗效果仍不尽人意。最近对RA的研究焦点主要在于其滑膜的类肿瘤性。滑膜组织中高水平表达的RTK活性以及存在的大量生长因子配体，提示RTK在介导RA滑膜细胞的转化表型和侵蚀性行为方面起举足轻重的作用。但何种生长因子最为重要以及是否还存在另外的酪氨酸激酶，现在尚无法回答。通过研究RA滑膜中的RTK，不仅可以阐述已知的RTK表达水平，还可能发现对RA发病起重要作用的新的RTK。针对RA发病起中心作用的RTK设计抑制剂，可能是未来治疗RA的突破口。

　　 作者单位：100044北京医科大学人民医院关节病诊疗研究中心(燕太强、吕厚山)，第四军医大学生化及分子生物学教研室(药立波)

参考文献

　　1　Lafyatis R,Remmers EF,Roberts AB,et al.Anchorage-independent growth of synoviocytes from arthritic and normal joints:stimulation by exogenous platelet-derived growth factor and inhibition by transforming growth factor-beta and retinoids.J Clin Invesr,1989,83:1267-1276

　　2　Lafyatis R,Thompson NL,Rhemmers EF,et al.Transforming growth factor production by synovial tissues from rheumatoid patients and streptococcal cell wall arthritic rats:studies on secretion by synovial fibroblast-like cells and immunohistologic location.J Immunol,1989,143:1142-1148

　　3　Williams WV,VonFeldt JM,Ramanujam T,et al.Tyrosine kinase signal transduction in rheumtoid synovitis.Semin Arthritis Rheum,1992,21:317-329

　　4　Yarden Y,Ullrich A.Growth factor receptor tyrosine kinase.Ann Rev Biochem,1998,57:43-78

　　5　Ullrich A,Schlessinger J.Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity.Cell,1990,61:203-212

　　6　Migita K,Eguchi K,Tsukada T,et al.The role of protein kinase in human synovial fibroblast growth.Biochem Biophy Res Commun,1995,210:1066-1075

　　7　Shiozawa S,Shiozawa K,Tanaka T,et al.Human epidermal growth factor for the stratification of synovial lining layer and neovascularisation in rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis,1989,48:820-828

　　8　Sano H,Engleka K,Matherm P,et al.Coexpression of phosphotyrosine-containing proteins,platelet-derived growth factor-B,and fibroblast growth factor-1 in situ in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and Lewis rats with adjuvant or streptococcal cell wall arthritis.J Clin Invest,1993,91:553-565

　　9　卢建.细胞因子受体的组成、结构功能及信号传导机制.生理科学进展，1995，26：305-311

　　10　Reamers EF,Sano H,Lafyatis R,et al.Production of platelet derived growth factor B chain (PDGF-B/c-sis) mRNA and immunoreactive PDGF B-like polypeptide by rheumatoid synovium:Coexpression with heparin binding acidic fibroblast growth factor-1，J Rheumatol,1991,18:7-13

　　11　Kypta RM,Goldberg Y,Ulug ET,et al.Association between the PDGF receptor and members of the src family of tyrosine kinases.Cell,1990,62:481-492

　　12　Migita K,Eguchi K,Aoyagi T,et al.The effects of the immunosuppressant rapamycin on the growth of rheumatoid arthritis (RA) synovial fibriblast.Clin Exp Immunol,1996,104:86-91

　　13　Melnyk VO,Shipley GD,Sternfeld MD,et al.Synoviocytes synthesize,bind and respond to basic fibroblast growth factor.Arthritis Rheum,1990,33:493-500

　　14　Nakashima M,Eguchi K,Aoyagi T,et al.Expression of basic fibroblast growth factor in synovial tissuse from patients with rheumatoid arthritis:detection by immunohistological staining and in situ hybridisation.Ann Rheum Dis,1994,53:45-50

　　15　Allen JB,Manthey CL,Hand AR,et al.Rapid onset synovial inflammation and hyperplasia induced by transforming growth factor beta.J Exp Med,1990,171:231-247

　　16　Kawakami A,Eguchi K,Matsuoka N,et al.Inhibition of fas antigen-mediated apoptosis of rheumatoid synovial cells in vitro by transforming growth factor β1.Arthritis Rheum,1996,39:1267-1276