微管相关蛋白tau与Alzheimer病神经原纤维退变

　　Alzheimer病(AD)是成人痴呆症中最常见的一种。神经细胞内的神经原纤维缠结(NFT)是其特征性脑损伤之一。NFT的主要组成成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau,这种tau蛋白以聚集的双螺旋丝(PHF)存在。越来越多的实验证明:NFT引起的神经原纤维退化在AD发病中起重要作用。本文将近年来对AD神经原纤维退化的分子机制以及抑制这种退变的可能性方面的研究作一综述。

　　一、 AD神经元微管相关蛋白tau的异常修饰

　　正常tau蛋白是一种含磷蛋白质,每克分子tau蛋白中磷酸含量为2～3克分子。在AD患者,tau蛋白被异常过度磷酸化,从而使每克分子tau蛋白的磷酸含量增高至5～9克分子［1］（注：1M=1mol/L）。AD脑中微管相关蛋白tau的含量显著高于对照者,而升高的tau蛋白中以异常过度磷酸化的形式为主［2］。异常过度磷酸化促使tau聚集形成PHF。已发现PHF-tau至少在21个位点发生了异常磷酸化。有趣的是:PHF-tau中的这些异常磷酸化位点大部分都存在于大鼠及人类胎脑tau蛋白中［3］。据此有人推测:AD脑中tau蛋白异常磷酸化可能与大脑发育过程中控制tau磷酸化的途径激活或在发育过程中特异性蛋白磷酸酯酶的失活有关。其确切机理有待更进一步的探讨。除异常过度磷酸化外,AD脑中tau蛋白还被异常糖化/糖基化［4，5］。糖基化和糖化分别代表两种完全不同的生化过程［4］。

　　用不同生化分离技术可将AD-tau蛋白分成三个级分:(1)胞浆非异常修饰tau(C-tau)；(2)异常修饰易溶型tau(AD P-tau)；(3)异常修饰并聚集为PHF的tau蛋白(PHF-tau)［1］。根据PHF-tau在2%十二烷基硫酸钠(SDS)中的溶解性质差异,又可将其分为PHF Ⅰ-tau和PHF Ⅱ-tau两种。从病理学意义上,AD脑中tau蛋白的上述不同存在状态可能反映了神经原纤维退化的不同发展阶段,即正常tau(C-tau)首先被异常磷酸化成AD P-tau,然后再通过一个目前尚不完全了解的机制聚集成PHF-tau。PHF Ⅱ-tau蛋白被部分泛素化修饰［6］，因为泛素是一种蛋白水解酶，PHF Ⅱ-tau的泛素化可能是机体试图对其进行水解清除的一种代偿反应。异常修饰的AD tau对Ca2+激活的中性蛋白水解酶抗性增加［7］。

　　二、 蛋白磷酸酯酶在tau蛋白异常磷酸化中的作用

　　AD脑中蛋白磷酸酯酶（PP）-2A,PP-2B, PP-1的活性均比年龄匹配的对照者低［8］。用PP-2A或PP-2B抑制剂处理培养神经母细胞瘤可导致tau蛋白的异常磷酸化［9］。在体外将AD P-tau分别与不同蛋白磷酸酯酶保温再定量检测其磷酸释放量, 发现PP-2A,PP-2B和PP-1分别可使异常tau蛋白水解释放其57%, 36%和30%的磷酸基［10］。此外,酶动力学研究资料也证明:PP-2A是活性最强的AD P-tau磷酸酯酶,其去磷酸化作用的Km值为（8.0±2.8）μmol/L［8］。PP-2A和PP-2B也可使PHF Ⅱ-tau蛋白不同位点去磷酸化，但此时需要的酶量远高于使AD P-tau去磷酸化所需的酶量［7］。Yamamoto等［11］也发现:使PHF-tau去磷酸化所需的PP-2A,PP-2B和PP-1的量远高于使胎脑tau去磷酸化所需的酶量，提示PHF/NFT结构的空间位阻效应可能不利于蛋白磷酸酯酶对其tau蛋白的去磷酸化作用。从上述研究资料可知：AD脑中蛋白磷酸酯酶的缺陷可能是导致tau蛋白异常磷酸化的主要原因。

　　PP-2A和PP-2B使AD异常磷酸化tau蛋白的去磷酸化活性可被Mn2+和Mg2+激活［7］，其中Mn2+的激活作用最强。此外,Ca2+/钙调素也可增高PP-2B使异常tau蛋白的去磷酸化活性。这些实验资料为AD预防治疗新药的开发提供了线索。

　　三、 去磷酸化对tau蛋白生物学活性的恢复

　　正常人脑tau蛋白的功能主要表现在两个方面：(1)与管蛋白结合形成微管；(2)与已经形成的微管结合以维持其稳定性。AD异常修饰的tau蛋白丧失其上述生物学活性。PP-2A,PP-2B和PP-1使AD P-tau去磷酸化后可不同程度恢复其生物学功能。以微管形成的初速度及最后形成量为参数,Wang等发现PP-2A对AD P-tau的生物学活性恢复能力比PP-2B和PP-1强［9］。此外,PP-2A和PP-2B的去磷酸化作用还可使PHF Ⅱ-tau不同程度恢复其生物学活性,同样，PP-2A对PHF Ⅱ-tau的活性恢复作用远强于PP-2B［7］。

　　单纯去糖基化处理不能恢复异常tau蛋白的生物学活性。然而,去糖基化预处理可增加其后的去磷酸化作用对tau蛋白功能恢复的程度［4］。由此可见，tau蛋白的异常磷酸化不是异常糖基化，而是其功能缺陷的直接原因。而这种缺陷导致的生物学功能的改变在体外实验中是可以被逆转的。

　　四、 去磷酸化和/或去糖基化对PHF/NFT结构的影响

　　与正常细胞骨架组分不同,PHF是以右手螺旋盘绕形成的双螺旋丝结构:其螺旋丝的直径约为22～24 nm,每80 nm处有一狭窄区,其直径约为10 nm。PHF Ⅰ在电镜下常见的是单个双螺旋丝,而PHF Ⅱ则常以缠结形式存在。将从AD脑中分离的PHF Ⅱ/NFT与PP-2A一起在体外保温一定时间，并进行负染电子显微镜检查,结果发现PP-2A可使PHF Ⅱ/NFT结构松解,这种松解作用随体外保温时间延长而变得渐趋明显。进一步的定量分析结果表明:PP-2A处理的PHF/NFT样品比对照组释放显著增多量的游离tau蛋白［7］。

　　内切糖苷酶F/N-糖苷酶F可选择性使AD P-tau和PHF Ⅱ/NFT中的tau去糖基化［4］。经糖苷酶处理的样品其螺旋结构消失,形成更加紧密,伸展束状的纤维丝结构,纤维丝的直径约为(2.5±0.5)nm。单纯去糖基化作用不能显著增加tau蛋白从PHF/NFT结构中的释放,然而,去糖基化后再用PP-2A处理可使PHF/NFT释放的游离tau蛋白量比单纯用PP-2A去磷酸化所释放的tau量显著增高［4，7］。提示:tau蛋白的异常磷酸化在PHF/NFT的形成及稳定性维持中均起作用, 而糖基化作用则主要与其结构的稳定性,尤其是PHF结构中螺旋的周期性维持有关。

　　有趣的是: 在体外将正常重组tau蛋白与AD P-tau一起保温,所形成的产物在电镜下呈直径为2.1～3.3 nm的线性纤维［12］， 这种纤维结构与PHF去糖基化后所形成的结构非常相似［4］。AD P-tau分子中既有异常磷酸化又有异常糖基化, 如果PHF中螺旋的周期性单纯由聚糖分子维持, 则正常tau与AD P-tau的反应产物应该是PHF。据此推测, PHF的形成可能还需要更多现在尚不明了的因素参与。tau蛋白异常磷酸化与异常糖基化的相关关系至今尚未明了。

　　五、 蛋白激酶在tau蛋白异常磷酸化中的作用

　　根据蛋白激酶催化磷酸化反应序列的特点,可将丝氨酰/苏氨酰蛋白激酶分为两大类型:(1)脯氨酸指导的蛋白激酶(PDPK),该酶催化底物磷酸化反应的序列特点是-X(S/T)P-(X-任一氨基酸，S-丝氨酸,T-苏氨酸,P-脯氨酸); (2)非脯氨酸指导的蛋白激酶（non-PDPK)。在已知的21个PHF-tau蛋白异常磷酸化位点中,约有半数为PDPK位点,另一半为non-PDPK位点。由此可见,可能有一个以上蛋白激酶参与了AD tau蛋白的异常磷酸化过程,但是,这些蛋白激酶的性质尚不十分清楚。由于上述激酶单独使用时对tau蛋白异常位点的磷酸化作用非常缓慢,提示tau蛋白并非是这些激酶的理想底物。 ManderKow小组报道:重组tau蛋白的ser-262位的体外磷酸化可完全抑制其与微管结合的功能［13］。Singh等发现:ser-262位的磷酸化只抑制约40%的tau蛋白生物学活性［14］，提示tau蛋白的生物学活性的表达与多个部位的磷酸化有关,而ser-262只是其中的一个。AD脑中GSK-3的表达量比对照者增高约50%,但没有检测到其酶活性的增强［15］。

　　六、 小结

　　AD脑中微管相关蛋白tau被异常过度磷酸化,在此基础上又被异常糖基化/糖化修饰;异常修饰的tau蛋白丧失其促微管组装的生物学活性;AD脑中蛋白磷酸酯酶活性降低,蛋白磷酸酯酶PP-2A,PP-2B和PP-1可不同程度使ADP-tau和PHF-tau去磷酸化,去磷酸化作用可不同程度恢复AD P-tau和PHF-tau的生物学功能,且其功能活性恢复程度与其去磷酸化程度呈正相关关系;PP-2A和PP-2B的去磷酸化处理可使PHF/NFT结构松懈，释放PHF原纤维及游离tau蛋白;去糖基化作用使PHF/NFT螺旋性消失,成为直径为(2.5±0.5) nm的线性束状纤维丝,这种纤维丝与在体外将正常人类tau与AD P-tau一起保温所得的纤维丝结构相似;单纯去糖基化作用不能显著增加AD P-tau和PHF-tau的生物学活性,也不显著增加PHF-tau蛋白的游离量,但去糖基化作用可增加其后的去磷酸化反应对tau功能的恢复及tau蛋白从PHF/NFT中的释放;多种非脯氨酸指导的和脯氨酸指导的蛋白激酶均可在体外催化tau蛋白发生磷酸化反应,但这些酶单独使用时均有非常缓慢的动力学;CaMKⅡ可催化tau蛋白262位丝氨酸发生磷酸化，但只抑制其促微管组装活性的40%;异常磷酸化的tau蛋白不易被CANP水解,去磷酸化降低tau蛋白对CANP的抵抗性。综上所述，可以得出如下初步结论:tau蛋白的异常修饰在AD神经原纤维退化中起重要作用,多种酶或膜代谢异常与tau蛋白异常修饰有关,蛋白磷酸酯酶及其激活剂可望对AD神经原纤维退化起抑制或逆转作用。

　　作者单位： 王建枝　　430030 武汉, 同济医科大学病理生理教研室

参考文献

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