抗HBV核酶的研究进展

　　乙型肝炎病毒（HBV）是引起乙型肝炎的病原体。在我国HBV感觉率达10%，而传统的抗病毒药物远期疗效均不显著，寻找新型抗HBV药物成为迫切需要。

　　核酶（Ribozyme）是一类具有生物催化功能的RNA，可定点切割RNA靶分子，从而达到有效阻断基因表达的目的[1]。通过合理的设计及操作，核酶可阻断HBV的复制及表达。所以在基因治疗领域倍受重视。

　　1 核酶的类型及设计

　　到目前为止，人们发现的核酶共有六种类型。即Ⅰ类内含子、RNaseP、锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎核酶和VS核酶。通过对这六类核酶组成及结构的研究，人们已经开始利用锤头状、发夹状核酶的特点，人工合成所需要的核酶。Weizsacker[2]、汤华[3]。竺来发等人[4]所设计针对HBV的核酶，均采用这种传统方式。Hselh等[5]则就HDV核酶研究对乙型肝炎病毒的阻断作用。对于核酶的合成，有两种方法。①是用DNA/RNA合成仪直接合成。②先合成核酶的双链或单链模板，然后用T4DNA连接酶将其整合并克隆至合适的表达载体，让其表达出核酶。这是一种简单、实用的方法。通过对这些核酶的深入研究，有助于有效控制HBV的感染。

　　2 提高核酶的稳定性

　　由于血清和细胞内含有大量的核酸酶，体内表达核酶存在被降解的可能。因此目前大多数研究致力于提高体外合成核酶的稳定性修饰，也有关于体内表达核酶的稳定性的研究报道。在体外许多研究针对2’-OH进行修饰，以增加核酶的稳定性。如Taylor设计的DNA-RNA杂合核酶，即与底物配部分用脱氧核苷酸替代。结果其体外活性提高6倍，稳定性提高2倍。Heidenreich则以2’-氟替代，发现提高了稳定性但也降低了剪切活性[6]。亦有以2’-甲基，2’-脱氨，2’-氨基，磷硫替代等修饰的报道。

　　核酶在细胞内提高稳定性则通过装在tRNA反密码环或在核酶末端引入茎环结构来进行。连建奇在核酶两端设计顺式核酶也是一种有效的方法[7]。

　　3 提高抗病毒效率的方法

　　①体外进化 目前用的核酶，均为人工设计，但即使合理设计的核酶，催化效率也低于天然核酶。根据RNA分子进行技术提出进行体外筛选方法，在抗HIV中已有报道，对抗HBV也是一种可行的方法。②多位点核酶的联合作用，针对靶RNA分子的不同位点进行多位点破坏，进一步提高核酶的剪切率，这样既可防止HBV的变异引起变异逃避，也可减少空间构型的影响。许多设计都采用了这种思路，如Weizsacker所用三个核酶的串联作用。③与定向技术相结合，如用HBV外膜蛋白包装含有HDV核酶的弱毒株，可使其定向作用于靶器官肝脏。日本学者山田修平设计抗HCV的核酶时，使用唾液粘蛋白定向等等。④核酶与反义技术相结合。核酶与RNA诱饵（decoy）相结合，这种方法在抗HIV核酶中已有许多研究，如Homman等人的报道，抑制效率可提高4～7倍[8]。

　　4 目前的研究现状

　　抗HBV核酶的研究是核酶应用研究的一个热点。竺来发等人设计针对HBcAgmRNA编码序列的核酶。在Mg++存在下，将137nt的核酸准确地水解得到97nt和40nt两个片段，可有效地剪切HBV的mRNA。王平等人针对HBV的前c/c基因设计了锤头状核酶，经体外转录后可定点切割靶RNA[9]。同时在HepG2细胞中亦可显著抑制HBeAg、HBsAg的表达。Weizsacker构建了串联的核酶，分别针对HBV2029、2044、2049位点，结果表明三个核酶同时具有剪切作用，Beck设计也针对HBV包装点的锤头状核酶，体外剪切靶RNA，用U6snRNA表达核酶与HBV共转染，也可有将效切割RN[10]。Hsieh则将丁型肝炎核酶改造，利用外膜为HBsAg的特点。可将抗HBV的核酶靶向导入肝细胞中，为乙型肝炎治疗提供了一条新途径。Welch使用三个发夹状核酶，在Huh7细胞中与HBV共表达，使其表达下降66%，对核酶修饰后，则抑制率达83%。真核细胞表达的成功，预示对HBV基因治疗是可行的[11]。

　　5 存在问题及展望

　　抗HBV核酶的体外、体内的应用研究已取得了很大进展，但目前还有诸多问题问题尚待解决，如怎样选择敏感的靶位点，如何使核酶进入细胞，如何提高核酶的稳定性等。但就技术本身的发展潜力巨大。从已经进行的抗HIV核酶Ⅰ期临床实验中，我们已经看到了抗HBV核酶发展的曙光。

　　参考文献

　　1 Kruger k,Grabowski PJ,Zaug AJ,et al.Selfsplicing RNA:Autoexcision and autocy clixation of the ribosomal RNA intervening sequence of tetrahymena.Cell,1982,31:147.

　　2 Weizsacker f,Blum H,Wands JR,Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA template.Biochem Biophys Res commun,1995,214(1):36.

　　3 汤华，闻玉梅，何丽芳。核酶的体外合成及其对鸭乙型肝炎病毒S基因体外转录物的定点切割。病毒嘡报，1994，10（4）：307。

　　4 竺来发，易荣大，陆长德，等。乙型肝炎病毒adr亚型核心抗原RNA片段的体外ribozyme定点切割。生物化学与生物物理学报，1993，25（3）：313。

　　5 Hsieh sY,Taylar J.Delta virus as a vecter for the delivery of biologically-active RNAs possibaly a ribozyme specific for chronic hepatitis B virus infection.Adv Exp med Biol,1992,312:125

　　6 Hiedenreich o.Eckstain F.Hammerhead ribozyme mediated cleavage of the long termmal repear rNA of human immunodeficiency virus type 1.J Biol chem.,1992,267(3):1904

　　7 连建奇，周永兴，金由辛。抗HBV c区基因核酶自剪切转录载体的构建。第四军医大学学报，1997，18（4），371。

　　8 Homann m,Tzortzakaki S,Rittneark,et al.Incorporation of the catalytic domain of a hammer-head ribozyme into antisense RNA enhances its inhibitory effect on the replication of human immunodeficiency virus type 1.Nucleic Aids res,1993,21:28009

　　9 王平，徐炜，曾力宇，等。核酶Ripc对HBV基因体外转录物的作用。病毒学报，1993，9（3）：278。

　　10 Beck j,Nassal M.Efficient hammerhead ribozyme-mediated cleavage of the structured hepatitis Bvirus encapsidation signal in vitro and in cell extracts,but not in intact cells.Nacleic Acids Res,1995,23(24):4954.

　　11 Welch pJ,Tritz R,Yei S,et al.Intracellular application of hairpin nbozyme genes against hepatitis B virus.Gene Ther,1997,4(7):736.