胶质瘤基因治疗的进展

　　胶质瘤基因治疗的实验研究始于80年代末。随着分子生物学技术的进步和肿瘤发病机制研究的深入，恶性肿瘤的基因治疗越来越受到重视，本文将胶质瘤在突变补偿、分子化疗和遗传性免疫增强三方面的研究情况加以综述。

　　1　突变补偿

　　目前对肿瘤的病因学研究发现，肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。突变补偿就是消除激活的癌基因或增强抑癌基因的功能。

　　1.1　消除激活的癌基因　包括反义核酸、核酶和单链抗体技术。反义核酸是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。癌基因反义核酸的导入，抑制了癌基因编码蛋白质的合成，从而抑制癌基因的功能。胶质瘤常过表达一些生长因子。TGF-β是一种T细胞抑制因子，用反义TGF-β表达质粒转导9L胶质肉瘤细胞，可使荷瘤鼠长期生存率达100％，12周后肿瘤消失，淋巴结效应细胞增加了3～4倍［1］。VEGF可促进血管内皮细胞的分裂，把VEGF／VEGFR的通路打断，可抑制肿瘤血管的形成。Saleh等［2］把C6胶质瘤细胞用反义VEGF的真核表达载体转导，VEGF的表达水平下降，组织学检查见肿瘤内血管数目减少且有很大程度的坏死。肽生长因子bFGF对胶质瘤的增殖、浸润有刺激作用。反义bFGF使U-87胶质瘤细胞增殖被抑制70％［3］。Trogan等［4］发现恶性胶质瘤有IGF-1异常表达，此表达异常可促进肿瘤的生长；反义IGF-1的导入，成功治疗了转基因鼠的脑内胶质瘤。

　　虽然反义核酸治疗恶性肿瘤有一定效果，但也有局限性，不能转运足够的反义核酸到靶细胞而达到长期逆转肿瘤的目的，现已设计了一种具有催化活性的反义RNA，又被称为核酶（ribozyme），它不仅可与RNA结合，同时还能使其裂解，可反复使用。多形性胶质母细胞瘤（GBM）表达CD44粘附分子，设计了两种锤头核酶（ham merhead ribozymes）来抑制CD44的表达。两种核酶定靶于CD44的外显子2上，对转录的CD44S、CD44R1RNA进行剪切，流式细胞仪（FCM）检测显示了其对CD44转录的裂解作用，这样降低了CD44的表达［5］。

　　单链抗体技术是利用抗体的特异性和高亲合特征，对表达抗体的基因进行操作，使其在抗原结合区表达，又被称为内抗体（intrabody）。erbB2在许多肿瘤，特别是一些腺癌中过表达，将erbB2单链可变区抗体（scFV）基因导入肿瘤细胞内，可抑制erbB2跨膜蛋白质的过表达，引起明显的细胞生长抑制［6］。这种“敲除”（knockout）癌基因的方法很有效，也很有前途，但这方面报道较少。

　　1.2　增强抑癌基因的功能　P53是普遍公认的抑癌基因，是一种多功能蛋白质。它可以调节转录，监控细胞周期，激活细胞凋亡，控制DNA的复制与修复，也发挥着保持基因组稳定的作用。许多肿瘤都发生P53的点突变，突变使P53抑癌功能丧失，而获得了肿瘤的形成能力。Frankel等［7］报道，在40例胶质瘤中有16例（40％）发生了P53突变。Badie等［8］用AdP53转染9L细胞进行体内、外试验，PCR和Westennblot证实了P53的转录和表达，抑制了肿瘤细胞的生长，使肿瘤体积缩小。Morita等［9］对521例多形胶母细胞瘤病人进行回顾性分析，其中10例生存期≥7年，这10例中有4例P53过表达，表明GBM病人的长期生存可能与P53的过表达有一定的关系。

　　新近又发现一种抑癌基因P21WAF1／CIP1，为野生型P53激活片段，也是周期依赖激酶的抑制剂。用AdP21WAF1／CIP1转导肿瘤细胞，可抑制其增殖和肿瘤形成。P16（CDKN2／MTS1）是一种具有许多特性的肿瘤抑制基因，在胶质瘤中缺失率高达50％。Fueyo等［10］用Ad5RSV-16将P16基因导入胶质瘤细胞，可直接合成功能性的P16，明显抑制了细胞的生长，改善了被转导细胞的恶性表型。

　　2　分子化疗

　　该方法是将毒素基因释放到肿瘤细胞而达到化疗“辐射”的作用。在这方面研究最多、最深入的是HSV-TK／GCV系统。HSV-TK基因表达产物可使对哺乳细胞无毒或低毒的核苷类似物（GCV或ACV）转换成毒性的GCV-TP，抑制DNA多聚酶并掺入到DNA链中，导致肿瘤细胞的死亡。有关这方面报道较多，大多是采用产生HSV-TK的逆转录病毒颗粒的包装细胞转导各种胶质瘤细胞，GCV治疗后，发现肿瘤完全消退。也有对转导动力学和毒性进行了试验，发现该系统对小鼠、大鼠和猴基本是安全的；也未检测到插入突变和有复制能力病毒的产生。胶质瘤细胞处于活跃的增殖状态，易被自杀基因TK转导。但也存在正常细胞转导表达TK基因导致组织损伤的可能性，如肠上皮和骨髓细胞被转导可引起腹泻和骨髓抑制，为此，研究者们克隆了只在特异组织表达的启动子基因，用MBP启动子与HSV-TK结合就可只转导胶质瘤细胞，GCV治疗后使肿瘤消退，避免了腹泻和骨髓抑制等副作用［11］。

　　对HSV-TK基因的转导开始多采用逆转录病毒，近几年开始尝试用其它载体，如单纯疱疹病毒本身，腺病毒及质粒DNA的直接注射等，对单纯疱疹病毒进行操作，保留其TK基因，去除那些编码神经毒性的基因如RR（核糖核酸还原酶）基因，成为单纯疱疹病毒的突变体hrR3，用此载体结合GCV治疗胶质瘤很有效［12］。腺病毒以其极高的转导效率及安全性备受青睐。Maron［13］用腺病毒把HSV-TK导入C6胶质瘤中，GCV治疗后，肿瘤体积缩小28倍，生存期延长了4倍。也有学者把含有HSV-TK的质粒直接注射来转导，这种质粒表达载体较安全，易构建。也可应用较强的启动子和脂质体包裹提高转导效率和表达时间。HSV-TK／GCV是第一个被批准用于人恶性胶质瘤临床试验的基因治疗系统。Oldfield［14］报道7例接受HSV-TK／GCV治疗的病人，其中5例肿瘤缩小，临床效果和安全性都较好。其它研究机构有关这方面的报道尚少，总之仍处于实验阶段。

　　3　遗传性免疫增强法

　　本策略是通过增强免疫反应而获得有效的抗肿瘤效应。可通过细胞因子、导入肿瘤相关抗原和其刺激分子来实现。细胞因子是调控免疫反应所必需的。把细胞因子导入肿瘤、抗肿瘤效应细胞（LAK，CTL，TIL）或易于移植和在体内长期存活的载体细胞，使在肿瘤局部分泌高浓度的细胞因子，发挥抗肿瘤效应。目前已报道用于胶质瘤基因治疗的细胞因子很多，有IFN-γ、IFN-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、M-CSF等。Wei［15］和Nam［16］分别用NIH3T3和内皮细胞把IL-4和IL-2导入C6和9L肿瘤内，可见肿瘤生长明显受抑，荷瘤鼠生存期延长。组织化学检测在注射部位有小胶质细胞、吞噬细胞、CD8＋NK细胞的浸润。Sobol等［17］报道了1例星形细胞瘤病人，用自体肿瘤细胞混合IL-2基因修饰的成纤维细胞，分10次皮下注射，病人细胞免疫反应增强，治疗4周后，肿痛有明显的坏死。但是，由于细胞因子生物学作用多样性，其与疾病发生发展的关系相当复杂，加上细胞因子在体内处于一个复杂的细胞因子网络（Cytokinenet-work）之中，并受到整体调节，如何在体内充分发挥其治疗作用仍需进一步研究。

　　肿瘤的发生与肿瘤细胞逃避机体免疫反应有关，这是由于肿瘤细胞免疫原性比较差，不足以刺激机体产生抗肿瘤的免疫反应。导入肿瘤相关抗原，提高肿瘤细胞的免疫原性，从而达到抗肿瘤的目的。Asai［18］把s-myc基因与巨细胞病毒启动子结合转导C6、9L胶质瘤，抑制了肿瘤的形成。这是由于s-myc的表达刺激C6、9L肿瘤相关抗原提呈给T-淋巴细胞，激活了宿主的免疫反应。缺陷型单纯病毒Ⅰ型（dlsptk）治疗胶质瘤有效，部分是由于病毒的感染，肿瘤细胞表面产生新抗原而诱发的免疫反应所致。B7是激活CTL细胞的第二个信号，B7分子的导入可激活CD8＋CTL细胞，引起肿瘤消退。Yang等［19］把B7·2cDNA用质粒导入P815细胞中，引起P815肿瘤的消退，而且对P815的再次攻击产生抵抗。Zitvogel［20］把IL-12和B7·1共同导入肿瘤细胞中，抗肿瘤效应更明显。这种联合应用两种或多种方法可能成为今后治疗肿瘤的一个方向。

　　目前进行胶质瘤基因治疗的方法和策略很多，但都处于实验阶段。几种用于人肿瘤基因治疗的方法中，疗效满意的并不多。基因治疗的发展受限于分子生物学技术和肿瘤病因学的研究进展，根据肿瘤是一种多基因遗传病的理论推测，随着胶质瘤所涉及恶性转化的所有异常基因表达的阐明，这种针对肿瘤发生的基因治疗，一定会有美好前景。