原子力显微镜在生物医学中的应用

 　1 原子力显微镜工作原理

    原子力显微镜（Atomic force microscopy，AFM）是一种以物理学原理为基础，通过扫描探针与样品表面原子相互作用而成像的新型表面分析仪器。它属于继光学显微镜、电子显微镜之后的第三代显微镜。AFM通常利用一个很尖的探针对样品扫描，探针固定在对探针与样品表面作用力极敏感的微悬臂上。悬臂受力偏折会引起由激光源发出的激光束经悬臂反射后发生位移。检测器接受反射光，最后接受信号经过计算机系统采集、处理、形成样品表面形貌图像。早期研制的为接触式原子力显微镜，它包括恒力模式和恒高模式。前者利用反射光位移引起的光电二极管输出电压的变化构成反馈回路控制压电陶瓷管伸缩，从而调节固定于扫描器上样品的位置，保持样品和探针间作用力（悬臂弯曲度）不变，测量每一点高度的变化。后者保持样品和探针间的距离不变，测量每一点作用力的大小。这种模式在调节探针与样品距离前即可直接观测悬臂弯曲度的改变。除传统的接触式之外，1993年又研制出轻敲式原子力显微镜。该显微镜在扫描过程中探针与样品表面轻轻接触，悬臂受存在于两者间的排斥力作用随样品表面起伏发生高频振颤。由于探针与样品的接触短暂，因此它更适用于质地脆或固定不牢的样品 ［1］ 。

    2 原子力显微镜的应用

    在AFM诞生最初的一段时间主要应用于电化学、材料科学等领域。近些年，人们逐渐探索着运用AFM对生物样品进行纳米水平的观测及显微操作等。与其它显微镜相比，AFM的纳米量级的高空间分辨率尤为突出，横向分辨率可达0.1～0.2nm，纵向分辨率高达0.01nm。此外，它不但能够对生理状态下的样品成像，而且可以实时动态地研究样品结构和功能的关系。故而，AFM成为纳米尺度上研究物质结构、特性和相互作用的有力手段。以下主要对这项纳米技术在生物医学研究领域中取得了显著的成绩作一综述。

    2.1 形态结构 作为新兴的形态结构成像技术，AFM实现了对接近自然生理条件下生物样品的观察。这主要由于它具备以下几个特点:（1）与扫描电镜和透射电镜这些高分辨的观测技术相比，样品制备过程简便，可以不需染色、包埋、电镀、电子束的照射等处理过程;（2）除对大气中干燥固定后样品的观察外，还能对液体中样品成像;（3）可以根据观察者的要求，调节样品所处的温度、湿度、大气、真空等观察条件。目前，AFM已广泛地应用于细胞及蛋白、多糖、核酸等生物大分子结构的研究中。对一个细胞而言，AFM不但能够提供长度、宽度、高度等形态方面的信息，还可以满足人们对膜上的离子通道、丝状伪足、细胞间连接等细微结构的研究 ［2，3］ ，甚至还可清楚地观察到膜身的骨架结构 ［4］ 。后者对细胞表面与表面下结构相互作用的进一步研究非常有利。Qian ［5］ 等利用AFM对酵母的热休克蛋白Sis1与Ssa1进行观察，发现只有Ssa1的lid区一端与Sis1缩氨酸结合区作用，并且Sis1二聚体的缩氨酸结合区呈现较高水平的凹槽结构，这有助于阐明蛋白相互作用机制及其在蛋白折叠、组装、降解、转移中的重要作用。定的生理生化反应会引起生物样品空间结构的变化。利用AFM对这些变化的观察，为细胞结构及结构调节的生理意义等研究提供更多有价值的信息。例如Liu ［6］ 等将大麦的中期染色体经严格点干燥、2M NaCl处理后提取出2种非组蛋白。通过AFM在纳米水平显示提取蛋白后染色体的三维结构，发现处理后的染色体发生下列变化:高度降低同时表面较前粗糙。又如:Sit ［7］ 将纤维蛋白原固定在3种不同基底表面，研究样品发生的结构变化。由AFM的三维定量分析显示纤维蛋白原按照mica

    2.2 力学特性 由于利用AFM可对扫描各点高度及作用力的测量，这就意味着我们不仅可以获取生物样品的表面形态和三维结构，还可以得到其表面硬度、粘弹性、摩擦力等力学特性的表面图谱 ［10］ 。例如AFM在扫描样品时，探针尖端作用样品可使样品产生可测量的凹陷。当应力与应变力成线性关系时，样品发生的变形属弹性变化，即撤销力时样品可恢复原有形态。我们利用凹陷的深度数据就能够获取有关样品局部的弹性信息。Alcaraz ［11］ 等利用AFM测量支气管上皮和肺泡上皮细胞在不同负荷力和作用频率下的复剪切弹性系数，观察其变化规律。在样品表面性能测量中，应该考虑到探针可能同时会受到其他作用而影响实验数据。在该实验中作者就针对溶液粘性牵拉力及与样品接触的探针几何形状引起的偏差予以校正，使测量结果更准确。

    2.3 分子间力 将很高的空间分辨率与敏感且准确的力学感应性相结合，是AFM的一个极为显著的特点。通过将探针连接在弹性系数很小的悬臂上，AFM对力的测量敏感性可达到pn水平。到目前为止，AFM已经广泛地运用于测量溶液中生物分子间相互作用如与生物反应有关的水合力的研究 ［12］ 。利用这些研究结果还有助于对生物分子结构和机械性能进行分析。例如，蛋白质依靠多种非共价作用而保持其结构稳定，通过机械或化学的方法将蛋白伸展后，可以利用AFM直接测量稳定蛋白结构的作用力，并进一步探究这些力对蛋白结构的影响。近几年AFM对肌蛋白titin的去折叠研究取得的显著成果即有力地说明了这一点 ［13］另外，AFM还能够测量单个分子间微弱的非共价力。例如测量受体-配体的去结合力，若受体固定在基底表面的话，则将与之对应的配体固定于探针表面，使探针功能化。随探针-样品的距离逐渐缩小，悬臂受探体-样品间吸引或排斥力的作用向接近或远离样品的方向偏折，悬臂偏折的最大幅度反映分离紧密结合两分子所需的力。在测量中，有可能会受到探针与表面的非特异性相互作用的干扰 ［14］ 。因此，有必要认真地选择对照实验包括使用未功能化探针;或基底所处的溶液中利用游离的配体封闭受体;调节溶液的离子强度或pH，降低静电力的干预 ［15］ 。除此之外，探针还有可能受溶液粘性牵拉力作用，使撤离速率减慢至记录数据低于实际的作用力。

    2.4 显微操作 通过在纳米级水平调控探针的位置和施加力，AFM可以实现对生物分子进行物理操作如切割生物结构，转移分子至特定位置。在一定的范围调整施加力，AFM在成像的同时即可对样品进行操作。施加力的范围主要由悬臂的力学常数和探针粗细决定。与标准显维切割技术相比，AFM对目标区域切割、提取等操作具有更准确的特点。1992年Hansma ［16］ 利用AFM切割遗传物质DNA分子的特定位置，这是人们首次使用AFM对生物分子进行的可控性纳米操纵。随后它在生物膜的切割 ［17］ 、待研究分子的分离 ［18］ 等方面也得到广泛的应用。

　　3 AFM在染色体研究方面的进展

　　AFM的高分辨成像和简便的样品制备过程吸引了众 多学者利用它对染色体结构进行研究。但早期由于镶嵌于30nm蛋白质层的RNA吸附在染色体的表面 ［19］ ，同时盐、细胞残渣等随同染色体滴片时吸附于玻片上 ［20］ ，妨碍染色体表面更细微的结构成像。近来随着染色体制备方法的改善和AFM成像技术的提高，该方面的研究得到进一步的发展。染色体经胃蛋白酶、RNA酶依次作用后，置于溶液中观察，不仅去除了表面的蛋白质层，而且再次水化后染色体体积增大5～7倍，能够分辨出样品表面的染色质纤维所形成的环状结构 ［19］ 。最近利用该方法使染色体成像横向和纵向分辨率分别可达到1nm、0.1nm，并且发现染色质纤维是由放射状排列染色质环与盘绕的螺旋管状结构共同组成 ［21］ 。在G、C分带中期染色体的三维结构观察 ［7］ ，染色单体型畸变识别 ［8］ ，核型分析等方面研究的应用证实了与光学显微镜、扫描及透射电镜等成像工具相比AFM具备独特的优势:它不仅能够识别染色体畸变，同时可以对结构变化进行细微的观察。除正常染色体的结构及表面性质的研究，AFM还对G分带染色体形态发生的一系列变化进行观察。研究发现随胰蛋白酶作用时间的延长，染色体除周边之外的其余结构将逐渐发生崩解 ［22］ 。中期染色体经G、C分带会出现纵向高度的差异 ［23，24］ ，各条带中染色质纤维排列的松紧度也有所不同 ［25］ 。这些都有助于染色体分带机制的阐明。对重离子射线诱发染色体畸变分析发现AFM不但识别出染色单体裂隙和单体断裂，还清楚观察到单体型畸变的断裂点纤维状结构 ［26］ 。这证实了AFM是辐射诱发染色体畸变的结构研究中十分有用的工具。可见，AFM已在染色体结构、物理性质等方面研究获得很大的进展。另外，作为一种纳米操纵工具，AFM还被用于纳米切割染色体，提取DNA制作FISH实验的探针等 ［27］ 。在亚细胞水平结构研究的基础上，发挥AFM连接亚细胞结构、分子水平研究的桥梁作用，它有可能在基因定位和功能研究等方面得到进一步的应用与发展。综上，凭借它对染色体纳米量极的成像和显微操纵，AFM有希望成为结合细胞遗传学和分子遗传学的有力工具。

    4 展望

    1986年，AFM作为一种新的成像技术被研制成功。在之后短短的十余年里它由原有的纳米水平单分子成像，逐渐扩展到表面功能的研究，分子间力的测量，可控性分子操作等多个领域。当然，不容忽视，在上述的AFM多种应用中仍存在一些有待进一步完善、解决的问题，也就是说，作为一个新兴的研究工具，它同样也存在着自身的不足。除了在实验中不断地分析、探求更好的解决方法之外，我们更应该将AFM与其他成像工具相结合，取长补短，以便能够更大程度地挖掘其内在潜力，使AFM在生物医学研究中做出更大的贡献。相信随着这项多功能技术的相关工作的不断发展，它会为形态结构、表面功能、相互作用力等方面研究提供更多、更重要的新发现。

    参考文献

    1 Moller C，Allen M，Elings V，Engel A，et al.Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces.Biophys J，1999，77（2）:1150-1158.

　　2 Avery，J，Ellis DJ，Lang T，et al.A cell free system for regulated exocy-tosis reocytosis in PC12cells.J Cell Biol，2000，148（2）:317-324.

　　3 Lal R，Lin H.Imaging molecular structure and physiological function of gap junctions and hemijunctions by multimodal atomic force microscopy. Microsc Res Tech，2001，52（3）:273-288.

    4 Braet F，de Zanger R，Seynaeve C，et al.A comparative atomic force mi-croscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.J Electron Microsc（Tokyo），2001，50（4）:283-290.

    5 Qian X，Hou W，Zhengang L，et al.Direct interactions between molecu-lar chaperones heat-shock protein（Hsp）70and Hsp40:yeast Hsp70Ssal binds the extreme C-terminal region of yeast Hsp40Sisl.Biochem J.2002，1;361（Pt1）:27-34.

    6 Liu X，Sugiyama S，Xu Q，et al.Atomic force microscopy study of chro-mosome surface structure changed by protein extraction.Ultrami-croscopy，2003，94（3-4）:217-223.

    7 Sit PS，Marchant RE.Surface-dependent conformations of human fib-ringogen observed by atomic force microscopy under aqueous conditions.Thromb Haemost，1999，82（3）:1053-1060.

    8 Martin AL，Davies MC，Rackstraw BJ，et al.Observation of DNA-poly-mer condensate formation in real time at a molecular level.FEBS Lett，2000，480（2-3）:106-112.

    9 Mulluer DJ，Sass HJ，Muller SA，et al.Surface structures of native bacte-riorhodopsin depend on the molecular packing arrangement in the mem-brance.J Mol Biol，1999，285（5）:1903-1909.

    10 Radmacher M.Measuring the elastic properties of living cells by the  atomic force microscope.Methods Cell Biol，2002，68:67-90.

    11 Alcaraz J，Buscemi L，Grabulosa M，et al.Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.Biophys J，2003，84（3）:2071-2079.

    12 Lee，ImShik;Marchant，et al.Force measurements on the molecular in-teractions between ligand（RGD）and human plateletα  Ⅱb β 3 receptor system Surface.Science，2001，491（3）:433.

    13 Marszalek PE，Lu H，Li H，et al.Mechanical unfolding intermediates in titin modules.Nature，1999，402，（6757）:100-103.

    14 Stuart JK，Hlady V.Reflection interference contrast microscopy com-bined with scanning force microscopy verifies the nature of protein-ligand interaction force measurements.Biophys J，1999，76（1Pt1）: 500-508.

    15 Marchant RE，Kang I，Sit PS，et al.Molecular views and measurements of hemostatic processes using atomic force microscopy.Curr Protein Pept Sci，2002，3（3）:249-274.

    16 Hansma HG，Vesenka J，Siegerist C，et al.Reproducible imaging and dissection of plasmid DNA under liquid with the atomic force micro-scope.Science，1992，256（5060）:1180-1184.

    17 Fotiadis D，Hasler L，Muller DJ，et al.Surface tongue-and-groove contours on lens MIP facilitate cell-to-cell adherence.J Mol Biol，2000，300（4）:779-789.

    18 Schabert FA，Henn C，Engel A.Native Escherichia coli OmpF porin surfaces probed by atomic force microscopy.Science，1995，268（5207）:92-94.

    19 Tamayo J，Miles M.Human chromosome structure studied by scanning force microscopy after an enzymatic digestion of the covering cell mate-rial.Ultramicroscopy，2000，82（1-4）:245-251.

    20 Fritzsche W，Henderson E.Mapping elasticity of rehydrated metaphase chromosomes by scanning force microscopy.Ultramicroscopy，1997，69（3）:191-200.

    21 Tamayo J.Structure of human chromosomes studied by atomic force mi-croscopy.J Struct Biol，2003，141（3）:198-207.

    22 Sahin FI，Ergun MA，Tan E，et al.The mechanism o G-banding de-tected by atomic force microscopy.Scanning，2000，22（1）:24-27.

　　23 Tan E，Sahin FI，Ergun MA，et al.C-banding visualized by atomic force microscopy.Scanning，2001，23（1）:32-35.

    24 Thalhammer S，Koehler U，Stark RW，et al.GTG banding pattern on  human metaphase chromosomes revealed by high resolution atomic-force microscopy.J Microsc，2001，202（Pt3）:464-467.

    25 Hoshi O，Ushiki T.Three-dimensional structure of G-banded human metaphase chromosomes observed by atomic force microscopy.Arch Histol Cytol，2001，64（5）:475-482.

    26 Murakami M，Minamihisamatsu M，Sato K，et al.Structural analysis of heavy ion radiation-induced chromosome aberrations by atomic forcemicroscopy.J Biochem Biophys Methods，2001，48（3）:293-301.

    27 Thalhammer S，Stark RW，Muller S，et al.The atomic force microscope as a new microdissecting tool for the generation of genetic probes.J Struct Biol，1997，119（2）:232-237.

    （编辑青 山）

    作者单位:100850北京军事医学科学院放射医学研究所