基质金属蛋白酶与骨改建

　　基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的蛋白酶家族。自1962年Gross和Lapie re首次报道胶原酶(Collagenase)以来，作用于ECM其它成分的基质金属蛋白酶不断报道。到目前为止已发现和纯化的MMPs至少有20种,已证实MMPs在几乎机体各种组织的发育和修复、肿瘤发生发展、炎症反应等过程中发挥着重要的作用，已愈来愈引起人们的重视。本文就MMPs在骨发育、代谢与再生等的改建过程中的最新研究进展进行综述。

　　1　MMPs的一般特性

　　MMPs是一组含Zn2+的能够降解细胞外基质的蛋白酶，通常在中性条件下发挥活性，有 ca2+参与时活性最大。其活性受螯合剂抑制，但不受丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶 类抑制剂的影响。用cDNA预测氨基酸序列，表明一些哺乳动物MMPs各种类型酶之间，其结构具有高度的恒定性。MMPs家族所有成员具有一些共同的氨基酸序列和结构域。这些结构域是：前肽结构域、信号肽、催化结构域、凝乳酶样结构域、跨膜结构域等。通过其中某个区的增减修饰而形成不同的MMPs。如明胶酶在催化区有一段纤维连接蛋白样的插入，MMP-7缺少凝乳酶样结构域，而膜型MMPs含有跨膜结构域等。MMPs均以酶原形式分泌，其活化需要进 行蛋白水解，前肽丢失，分子量减少。体外潜伏型MMPs可被有机汞制剂、促溶剂或蛋白酶激活。MMPs有一些共同的生化特点：①催化机制依赖于活化中心的锌原子；②蛋白酶均以无活性的酶原形式分泌；③酶原可被蛋白酶激活因子或有机汞制剂激活；④激活过程伴随分子量的减少；⑤不同细胞来源的MMPs有很高的同源性；⑥激活后的酶可裂解一种或多种细胞外基质成分；⑦酶的活性可被MMPs的天然抑制剂TIMPs抑制；⑧多数MMPs基因转录受到内源性生长因子和细胞因子调节，如IL-1和IL-6、TNF-α、TGF-α和IFN-γ以及BMP等。

　　2　MMPs的分类

　　MMPs根据其结构和底物特异性不同可分为5大类：①间质胶原酶，包括MMP-1、-8、-13、-18，主要降解Ⅰ～Ⅲ型胶原及Ⅶ和Ⅹ型胶原，不能降解明胶、Ⅳ型和细胞外基质的其它蛋白成 分。胶原酶以潜酶原方式合成。MMP-1(Mr=54×103)是成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等细胞来源的成纤维细胞型胶原酶。而MMP-8(Mr=75×103)是由中性白细胞 合成分泌的中性白细胞胶 原酶；②Ⅳ型胶原酶，也叫明胶酶，包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B (MMP-9)。明胶酶 具 有降解变性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原明胶的特异能力，也可切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原。对纤维结合素、弹性蛋白也有一定作用。MMP-9(Mr=92×103)是糖化蛋白酶，主要来源于中性白细胞和巨噬细胞。MMP-2(Mr=72×103)是非糖化蛋白酶，来源于许多结缔组织细胞；③基质溶解素，包括基质溶解素-1 (MMP- 3)、基质溶解素-2(MMP-10)和基质溶解素-3(MMP-7)，有广泛的底物特性，可降解纤粘蛋白、层粘蛋白、弹性蛋白和糖蛋白的蛋白核心以及Ⅳ和Ⅸ型胶原等，另外还可去除Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型原胶原N、C末端肽，起原胶原肽酶作用。基质溶解素的细胞来源与MMP-1相似；④膜型MMPs，包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)以及近来分离命名的MT5-MMP。这种酶表达于细胞表面，除可直接降解基质，还对MMP-2和MMP-13有激活作用；⑤其它类，包括MMP-4、-5、-6、-20。这些未归类MMPs的作用较特殊，不能归类于其它MMPs。MMP-4被称为端肽酶，Mr为35×103，可从牙龈成纤维细胞培养液内分离。其作用是促进MMP-1接近胶原分子切割部位以加速胶原降解。MMP-5又叫3/4胶原肽链内切酶，Mr为54×103。具有胶原酶、明胶酶活性，可以继续降解MMP-1降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原所产生的天然3/4胶原片段。MMP-6适合pH=5.3的酸性环境，故被称为酸性金属蛋白酶。其细胞来源尚不清楚，Mr为55×103，可以消化软骨蛋白多糖。MMP-20在牙齿发育 过程中表达，能够分解牙釉质蛋白。

　　3　MMPs的激活

　　MMPs多数是以酶原形式分泌，其酶原体的胞外激活机制十分复杂且尚不完全清楚。胶原酶、明胶酶和基质溶解素的激活机制各不相同，现分述如下：①胶原酶的激活：血纤维蛋白溶解酶激活胶原酶原，使其Mr从55×103降为44×103，但酶活性较低。基质溶解素继续在Glu80-phe81位点切割使Mr进一步降为43×103，从而完全激活胶原酶，这时酶活 性提高近10倍。②明胶酶的激活：Mr为72×103的成纤维细胞明胶酶可被成纤维细胞参与的过程所激活。Seltzer等认为Integrin受体参与的信号传导途径参与Mr为72×103的明胶酶的激活。而Mr为95×103的明胶酶原可被血纤维蛋白溶解酶激活。另外有研究发 现一些细胞因子也可激活明胶酶。③基质溶解素的激活：基质溶解素可被结缔组织细胞通过依赖血纤维蛋白溶解酶原机制快速激活。此过程中血纤维蛋白溶解酶首先水解基质溶解素前肽，所产生的中间产物再进行自身催化切割而被激活。④MMPs之间的相互激活：研究表明部分MMPs之间可相互激活。例如MT1-MMP可激活MMP-2和MMP-13，而MMP-3、MMP-10在MMP-1的激活中起重要作用，同时也可激活MMP-2。

　　4　MMPs在骨改建中的作用

　　MMPs参与了全身组织的发育、改建以及疾病的病理过程。如胚胎发育、组织改建、创伤愈合、风湿性关节炎的关节破坏、牙周炎、肿瘤侵袭转移等。随着国内外学者对MMPs的研究日益深入，MMPs在骨胚胎发育、改建及病理过程中所起的关键作用引起人们的重视。

　　骨是一种特殊的结缔组织，由多种细胞和细胞间的骨基质组成。细胞成分为：成骨细胞(Ost eoblast)、骨细胞(Osteocyte)、破骨细胞(Osteoclast)。骨基质(bone matrix)主要成分为 ：胶原纤维(约占90%，主要属于I型胶原)、蛋白多糖(Proteoglycan)和骨盐(Bony salt)。骨改建是一个复杂的多步骤过程，多种细胞参与了此过程，其中破骨细胞和成骨细胞的作用最为关键。而成骨细胞和破骨细胞不仅依赖MMPs对骨基质成分的直接降解，而且需要MMPs参与介导成骨细胞对成熟破骨细胞的活化以及破骨细胞的迁移和贴附等过程。

　　4.1　破骨细胞活化过程中MMPs的介导作用

　　成熟破骨细胞的活化是骨吸收的前提，而成骨细胞通过分泌MMPs来完成对破骨细胞的活化过程。其中，MMPs中的胶原酶发挥重要的介导作用。Holliday等［1］发现在胶原酶抑制剂存在条件下破骨细胞的骨吸收作用被明显抑制，而在半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其它MMPs抑制剂存在条件下破骨细胞的骨吸收作用只能部分减弱。这表明邻近破骨细胞的基质细胞和成骨细胞通过释放大量胶原酶分解胶原产生胶原质片段从而激活破骨细胞的骨吸收作用。可见胶原酶不仅直接参与破骨细胞的骨吸收过程，而且是成骨细胞诱导破骨细胞骨吸收的中介因子之一。另外，PTH对骨吸收的诱导作用必须依赖胶原酶对I型胶原的裂解。Zhao等［2］的研究表明PTH直接作用于成骨细胞和基质细胞促进间质胶原酶转录和合成。从而间接促进破骨细胞的分化和骨吸收功能。Kusano等［3］认为IL-1、-6通过促进破骨细胞合成分泌M mPs来提高破骨细胞的骨吸收作用。

　　4.2　破骨细胞迁移和贴附过程中MMPs的作用

　　研究表明MMPs也参与了被活化的破骨细胞向矿化骨表面的移行和贴附过程。Sato等［4］在兔破骨细胞中检测到高表达的MT1-MMP，而且MT1-MMP与相应于板状伪足和伪足小体( podosome)区域的基底膜反应。推测MT1-MMP与破骨细胞的迁移和贴附有关。另外Sato等［4］将纯化的破骨细胞分别培养于涂或未涂胶原的骨片上。在未涂胶原的骨片上MMPs抑制剂未能抑制骨陷窝的形成，而在涂有胶原的骨片上MMPs抑制剂有效的抑制了骨陷窝的形成。使用其它类的蛋白酶抑制剂没有出现这种现象。表明破骨细胞依赖于部分MMPs的活动以移行到骨吸收区域。可见，MMPs不仅直接参与骨基质降解，而且破骨细胞的迁移和贴附也依赖于部分MMPs的活动。当破骨细胞移行骨吸收区域，骨表面的类骨质需要成骨细胞和衬里细胞等细胞释放胶原酶分解，以使破骨细胞贴附于矿化骨表面行使骨吸收功能。这一点在肿瘤细胞 对骨的侵袭时锚着于骨表面的过程中显得尤为重要。Ohishi等［5］在体外培养实验中发现与乳腺癌细胞H-31共同培养的成骨细胞所分泌的MMP-1明显增加。说明肿瘤细胞在诱导破骨细胞进行溶骨之前，必须动员成骨细胞合成分泌胶原酶以去除骨表面的类骨质。而在肿瘤转移时要突破的基底膜和细胞外基质中所包含的胶原也同样需要MMPs的降解。例如基底膜中的Ⅳ型胶原就需要明胶酶的特异分解。

　　4.3　破骨细胞溶解吸收骨基质成分过程中MMPs作用

　　破骨细胞在贴附于矿化骨表面后分泌酸性物质溶解矿物质，并在破骨细胞和骨表面之间形成密闭腔隙，将一些酶类分泌于其中来降解骨基质中的其它成分。在这些酶中MMPs起关键作用。现已证明有多种MMPs参与了骨基质的吸收过程，包括MMP-1、-2、-3、-9、-10、-13［3］以及MT1-MMP［6］和MT2-MMP等。这些MMPs根据不同的底物特异性分解骨基质中包括 胶原在内大部分蛋白成分。这一过程由MMPs单独完成或是与其它类蛋白酶共同完成。Sires等［7］研究表明MMPs在降解骨基质时与其它类蛋白酶有协调作用。例如胶原酶在降解Ⅹ型胶原时产生 mr=32×103的片段，而这个片段不能继续被胶原酶以及其它类基质金属蛋白酶降解。但却能被破骨细胞来源的组蛋白B快速分解。这一点也可从破骨细胞分泌不同蛋白酶存在一定顺序的现象中得到证明。Everts等［8］研究表明：在破骨细胞贴附于矿化骨表面后创造一个低pH值的吸收环境，在这个酸性环境中半胱氨酸蛋白酶首先发挥作用，降解部分骨蛋白。当pH值逐渐回升到中性时基质金属蛋白酶才开始行使其功能。

　　4.4　MMPs在骨的胚胎发育中的作用

　　骨的胚胎发育过程以骨的快速形成为特点，而在新骨骨基质堆积前必须依赖成骨细胞、破骨细胞或其它细胞合成分泌MMPs，溶解吸收骨表面的软、硬组织以及陈旧的骨内基质，为新骨开辟空间。在骨形成活跃处可检测到有大量高活性的MMPs表达说明了这一点。Rice等［9］通过原位杂交观测到胚胎发育16d的小鼠颅骨中破骨细胞分泌大量MMP-9，而且集中于骨形成活跃的区域。推测MMP-9在骨的早期发育中占有重要作用。Gack等［10］通过原位杂交在14d的小鼠胚胎的各种发育骨中检测到MMP-1，特别是在长骨中。这些MMP-1主要由骨形成活跃区域的肥大软骨细胞和成骨细胞分泌。推测MMP-1在胚胎发育阶段早期骨形成中发挥重要作用。

　　4.5　MMPs的调节对骨改建的影响

　　在正常的骨改建过程中MMPs的基因表达、转录和活性受到多种因素调节而维持在正常水平。例如BMP-2、-4、-6在mRNA水平和蛋白质水平抑制MMP-13合成［11］。Delany［12］等发现由成骨细胞分泌的基质溶解素-3在成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)短期作用下mRNA表达明显下降，基因转录并不受影响。而在FGF-2长期作用下基质溶解素-3的mRNA表达趋于稳定，基因转录却明显增加。TGF-β1通过抑制MMPs产生促使细胞外基质沉积。Mattot等［13］对小鼠胚胎发育的研究发现，在长骨和肋骨的肥大软骨细胞中或迁移到长骨骨形成区域的成骨细胞和内皮细胞中有胶原酶的转录积聚，而TIMP-2的基因转录要提前于胶原酶。提示TIMP-2不仅局限在转录后，而且在转录水平对其有调控作用。而在病理骨改建中对MMPs的调控作用的失调导致MMPs的过量表达。Rubin［14］等通过建立废用尺骨的动物模型研究胶原酶-1的表达，发现胶原酶-1在废用尺骨骨细胞中的表达明显高于正常尺骨。在对骨质疏松的研究中发现：在骨质疏松小鼠的胫骨中破骨细胞释放的MMP-9较正常小鼠高约4倍。Bord［15］等发现在正常的新生肋骨中破骨细胞持续表达一定数量的TIMP-1，而在病理性骨和异位骨中破骨细胞不表达或表达很少的TIMP-1。这表明TIMP与MMPs之间的平衡影响骨的转换和改建过程。

　　5　展望

　　骨的改建贯穿于人的整个生命过程，而包括基质金属蛋白酶在内的各种蛋白酶在骨改建中的作用被逐渐揭示的同时也日益得到人们的重视。特别是在骨的发育、生理改建和病理改建过程中各种调控机制对基质金属蛋白酶的作用机理有待进一步的研究。这将大大推动临床对于一些骨代谢失衡疾病如骨质疏松、佝偻病以及骨肿瘤的治疗。

　　金钫(第四军医大学口腔医学院，陕西　西安　710032)

　　段银钟(第四军医大学口腔医学院，陕西　西安　710032)

　　参考文献：

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