黄体退化的机理

　　排卵后滤泡发生一系列剧烈的变化，其颗粒细胞或卵泡膜细胞转变为黄体细胞的过程称为滤泡黄体化。黄体化的结果在卵巢皮层内形成真正的内分泌腺即黄体。绝大多数动物的黄体主要由颗粒细胞转化而成，但灵长类和大鼠的被膜细胞也是黄体组成成分。排卵后原滤泡中的囊腔很快被增殖的颗粒细胞充填，这些颗粒细胞在黄体化时由原来直径12～14μ m，增加到35～50μ m。细胞胞浆和核的比例增大，胞浆所含分泌颗粒和脂肪滴增加，并含有黄色色素，因而称为黄体。线粒体形态也发生变化，粗面内质网消失，同时滑面内质网增加，与这些形态变化相应的是黄体细胞具备了分泌孕激素的功能。黄体存在有一定的时限，这取决于动物是否已受孕。灵长类排卵后，黄体维持其形态和功能大约2周，然后，其细胞的功能和结构都自发地发生衰退。若发生妊娠，则绒毛膜促性腺激素可继续维持其结构和功能。非人灵长类和人类的黄体是在垂体黄体生成激素（ lH）控制下产生激素的， lH脉冲频率从黄体中期到后期开始下降，但是外源性高频率的 lH脉冲不延长黄体寿命[1]。这说明黄体相持续时间的长短是黄体的内在特性。黄体终结时，黄体细胞退化，孕激素分泌停止，血中孕激素水平下降（功能性退化），细胞数量减少， lH受体减少，细胞浆体积缩小，核固缩， dNA总数减少， dNA小片段增加（结构体退化）[2]。最后成纤维细胞侵入，将腺体转变为瘢痕组织——白体。

　　黄体功能和结构上的自行退化对于正常的月经周期是必不可少的。它使下一个月经周期正常启动，新的滤泡发育生长， lH高峰正常来临而随之排卵。基于黄体退化的重要性，生殖生理学家长期以来一直在研究黄体退化的生理机理。这主要涉及到体内的激素和一些生长因子，近来，许多研究者提出了黄体退化与细胞调亡相关[2-9]。本文就从这两方面来讨论黄体退化机理。

　　一、细胞凋亡学说

　　凋亡是指当细胞死亡时，形态学上的改变，这是发生在健康组织中个别细胞死亡的过程，又称为细胞程序性死亡（ cell programmed death ,CPD）。它表现出如下特征：胞膜起泡，细胞因脱水而体积缩小，细胞核断裂，染色质凝缩，最后细胞裂解成多个由膜性结构包裹的小球，称凋亡小体。它可被邻近的上皮细胞吞噬。整个过程不同于坏死，无细胞内容物外溢，不诱发炎症反应，细胞发生凋亡时，核小体间 dNA断裂，产生180～200bp或其整数倍的 dNA片断（低聚核小体），在 dNA琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“ ladder”带型，此过程是细胞凋亡最重要的生化变化[10]。核小体间 dNA的断裂由核酸内切酶引起。核酸内切酶是一种钙离子/镁离了（ ca++/Mg++）依赖的 dNA裂解酶，其以非活性的状态存在于大鼠黄体相的卵巢中[11]。

　　有实验证实，在黄体退化时，从形态和结构均可观察到细胞凋亡主要表现为核酸内切酶活性大大增加，并与低聚核小体（ dNA断裂）的出现成正比[4]。低分子的带直到黄体细胞退化及外源性前列腺素 f2α（ pGF2α）诱导后才出现。由于低聚核小体出现在血液和黄体的孕酮含量下降后，这就可明显区分功能性黄体退化（孕酮水平的下降）和结构性黄体退化（细胞体积缩小， dNA碎片含量增加）。孕酮浓度的下降发生在核酸内切酶的活性出现以前，因此，低聚核小体的发生不包括在黄体功能性退化时出现的孕酮含量下降阶段。但是，随黄体重量及 dNA总浓度下降，及低聚核小体含量上升的关系显示出凋亡在黄体结构退化中的作用。变性黄体细胞百分含量及小于2645碱基对 dNA百分量之间的高度相关性又进一步支持了这个学说，总之，核酸内切酶活性的出现，作为低聚核小体形成的标志，显示出黄体细胞退化时发生了细胞凋亡[11]。

　　细胞凋亡的调控又是一个非常复杂的过程，有多个基因参与，分别产生促进和抑制调亡的作用，近年来，人们力求寻找黄体退化的促发因子和有效蛋白质， wyllie[12]指出有一整套调节基因在影响细胞调亡的进度和难易性，同时指出，原癌基因 c-myc可能在其中发挥重要作用，它能编码寿命较短的转录因子，一方面促进细胞分裂增殖，另一方面促进细胞凋亡。它有时只在一些生长停滞的组织中表达出来，并与 cPD有关[13]。由于控制凋亡的基因存在着种族差异[14]，有报道用与人相似的非人灵长目模型来确定狒狒黄体中 c-myc蛋白[3]。实验发现，灵长类卵巢黄体中存在大量的 c-myc，它有一种潜在的自分泌功能，而在排卵前的卵泡中其含量很少。这提示 c-myc的生成和活化是发生在排卵过程和/或早期黄体化的过程中。免疫组化观察到此过程中染色信号由浅变深，说明 c-myc在此时合成。实验还发现中、后期黄体细胞显示出一种较为统一的中度的染色，说明此时 c-myc水平较稳定。在诱导出黄体退化过程中， c-myc着色发生变化，信号强度逐渐加深，显示出细胞凋亡时 c-myc的合成。信号的逐渐消失了又显示出细胞的死亡。总之，已证实 c-myc与黄体退化有关。而且在诱导黄化退化过程中， c-myc在细胞核或胞浆中的含量是不稳定的。说明 c-myc可能从胞浆转移到核内，并与其它因素一起来诱导 cPD而发生黄体结构性退化。

　　研究黄体退化时蛋白质的作用是近年来才开始的。 c-myc几个因素中的一。在大鼠，硫糖蛋白-2和胰岛素生长因子结合蛋白基因在黄体退化时都大量表达。在一些细胞中，生长因子可以确定细胞对原癌基因的反应[13]。可以假定，功能性黄体退化基本上包括未配对的 lH受体的下降[LH受体下降会导致环单磷酸腺苷（ cAMP）的下降及孕酮分泌的减少]；而结构性黄体退化包括生长因子的减少，这些生长因子的减少可以使细胞易受原癌基因产物的影响，就如 c-myc存在于整个黄体期，参与细胞凋亡和死亡一样。

　　黄体细胞凋亡可以是由体内基因激活的，是注定的发育过程中的程序性死亡，其确切的基因尚未知晓。理论上“死亡基因”需要符合两个条件：①单独就是足够引起黄体细胞死亡。②在黄体细胞发生 cPD时表达。目前在黄体细胞上发现有几种与凋亡有关的基因，如 c-myc， fas[8，9]， y81和 gasl[5]等。此外，黄体细胞凋亡还可以由其它原因引起，如：①信号欠缺引起黄体细胞自杀；黄体细胞生存如同黄体细胞繁殖一样需要从其它细胞获得信号，当缺乏这种信号时，内在自杀系统就被激活，其中包括合成特异的 mRNA和蛋白质（ dNA内切酶等），而抑制 rNA和蛋白质合成可抑制这种将死的黄体细胞死亡，从而认为基因的转录和 rNA转译是黄体细胞自杀所必须的。这种信号可能是妊娠时胚胎向母体发出的一些肽类化合物，如母体产生的妊娠相关因子（ pAG）和人绒毛膜促性腺激素（ hCG）等。黄体细胞只有在收到这些信号后才能继续生长，缺少这种信号黄体细胞通过经典 cPD而死亡。②引起黄体细胞调亡的因子，如前列腺素（ pG）和 tNF-α等诱发凋亡。

　　二、体内因子与黄体退化

　　黄体的基本功能是合成和分泌孕酮，这种激素可使子宫为妊娠做好准备。黄体还产生 pG，肽和其他因子。这些因子以内分泌，旁分泌和自分泌的形式在黄体退化过程中发挥作用。黄体功能的发育和维持需要 lH的刺激。若不发生受精，黄体就退化，而黄体的退化并不只是缺乏 lH的促黄体化支持。越来越的研究结果证实，体内诸多因素，如： pG、细胞因子、过氧化物等，均以不同的作用方式介入黄体的生理性退化过程。

　　（一） tNF-α和 iFN-γ

　　tNF-α是由巨噬细胞分泌的，而 iFN-γ则来自 t淋巴细胞，两者都被认为参与黄体退化的过程[15]。单独使用 iFN-γ（100U/ml）或与 tNF-α合用均可减少体外培养的牛黄体细胞的成活率[16，17]，而单独使用 iFN-γ（100U/ml）不能减少离体培养的鼠黄体细胞数量，只在高浓度（5000U/ml）时才起作用[18]，说明其诱导黄体退化的作用与动物种类有关。

　　黄体退化由两个阶段组成：功能性黄体退化和结构性黄体退化， pitzel[19]等报道了 tNF-α有抑制猪黄体细胞的基础孕酮分泌和 hCG刺激的孕酮分泌作用。 benyo等[17]发现 tNF-α可抑制 lH刺激的牛黄体细胞的孕酮分泌。这些报道说明巨噬细胞通过它们的分泌物 tNF-α参与了功能性黄体退化。另外还有报道[15，17]表明，巨噬细胞和 t淋巴细胞一起通过它们的分泌物 tNF-α和 iFN-γ以及它们的吞噬活性诱发结构性黄体退化。

　　fairdrild等[20]发现 iFN-γ可诱导黄体细胞表达出第二类主要组织不相容性抗原，并认为 t淋巴细胞通过增加免疫应答机理而参加结构性黄体退化过程。 toushung[18]发现 tNF-α和 iFN-γ合用可使离体培养的鼠黄体细胞中 dNA碎片占 dNA总量的百分率以及细胞核中 dNA碎片数量提高，这证实 tNF-α和 iFN-γ可通过细胞凋亡作用而诱导黄体细胞退化。

　　benyo[17]报道合用这两种细胞因子可显著提高培养4d后的牛黄体细胞分泌 pGF2α，并降低培养7d的黄体细胞存活率，此时 pGF2α含量显著升高。鉴于外源性的 pGF2α可诱导结构性和功能性黄体退化，因此这两各因子显著提高 pGF2α水平则可能是引起细胞凋亡的原因。另一方面，一些关于 tNF-α和 iFN-γ的细胞毒性效应机理的研究表明花生四烯酸代谢与细胞毒效应有关[21，22]。花生四烯酸代谢的增强表明了 pGF2α分泌的增加，而 pGF2α亦有诱导黄体退化的作用， tNF-α和 iFN-γ就间接发挥诱导黄体细胞凋亡的作用。

　　（二） pGF2α

　　灵长目中，卵巢的 pGF2α（可能是黄体的 pGF2α）起着生理诱导黄体退化的作用[23]。给恒河猴黄体中直接注射生理剂量的 pGF2α可引起黄体退化。相似的研究表明[24，25]，在妇女身上或猴黄体内给与药理剂量的 pGF2α，可短暂地降低血孕酮水平，1μ g/mlPGF2α对早、晚期黄体的孕酮生成无影响，但抑制妇女中期黄体细胞 hCG刺激下的孕酮分泌，而10μ g/mlPGF2α抑制晚期黄体在 hCG刺激下的孕酮分泌，但对早、中期黄体的孕酮合成影响不明显。这种差别可能是由于 pGF2α浓度不同造成的。

　　到目前为止， pGF2α诱导黄体退化的机理尚未完全弄清楚。有报道认为， pG可能通过自分泌或旁分泌的方式影响黄体细胞的功能[26]。体外研究表明， pGF2α能快速抑制 lH刺激的黄体组织的 cAMP积蓄和甾体生成。也观察表明 pGF2α诱导黄体退化是损伤 lH/hCG受体和 cAMP受体的活性的结果。这论点被以下现象所证实[27]：① hCG分泌量至少是血液中正常量的2倍才可维持早期黄体功能。②提高外源性 hCG剂量，可维持早期黄体的完整。③ hCG可抑制 pGF2α的诱导黄体退化的作用，提高 hCG浓度可降低黄体对 pGF2α的敏感性。 pGF2α可导致大鼠黄体组织磷脂酰肌醇4，5-二磷酸盐的裂解及包括三磷酸肌醇在内的肌醇磷酸盐的积累。三磷酸肌醇能将许多组织中的Ｃ a++从细胞内释放出，同时， pGF2α还可提高黄体细胞外的 ca++迅速内流，激活磷脂酶 c（ pKC），进一步增加胞内 ca++储备的释放。而 ca++的增加则可激活 ca++/Mg++依赖的核酸内切酶，此酶可使双链 dNA在核小体连接部位发生裂解。从而 dNA裂解成185碱基的低聚核小体，即， pGF2α通过促发细胞凋亡而溶黄体[28]。此外， ca++浓度上的升也可能激活其它的一些依赖钙离子的酶，例如 pKC被长期激活后可降低 mRNA编码的细胞色素 p450BCC和3β-HSD的水平，从而，黄体孕酮合成就受到影响。因此，提高离体培养黄体细胞内 ca++的浓度的可能是 pGF2α诱导黄体退化的细胞内媒介。 mark[29]等发现， pGF2α不影响黄体对脂蛋白的摄入，其主要作用点在胆固醇转运到线粒体，这是黄体退化中一个重要的激素介导的步骤。

　　总之，大量实验都证实 pGF2α是生理性黄体退化的重要因子，但作用机理仍需作一步探究。

　　（三）过氧化物

　　黄体的退化是细胞功能退化一个例子，它是哺乳动物生殖系统中非常重要的一步。对大鼠来说[30]，黄体退化与氧化反应的产物的增加有关，如未受伤的卵巢代谢过程中产生 o2-和 h2O2。这些产物中一类自由基的载体就是过氧化脂类，它出现在黄体细胞时伴随着促性腺激素受体的丢失， cAMP含量的下降，以及由此造成的黄体甾体合成能力的下降。近年来的研究已论述了在新鲜的离体大鼠黄体细胞中，过氧化物有明显的抗卵巢甾体激素效应，在黄体功能性退化过程中，大鼠黄体产生 h2O2，它能快速抑制对促性腺激素敏感的 cAMP的积累和孕酮的分泌[31]。 h2O2是 o2-作用的介导物，并是黄体退化的调节因素。其来源还不十分清楚，但在退化着的黄体细胞中的所出现的吞噬细胞和具有吞噬能力的白细胞均可产生这类过氧化物。

　　另外还有两种过氧化物， cuOOH和15（ s）-HPETE（ hydroper oxyeicosatertrae-noicacid）。 cuOOH（ eD5025μ m）可抑制 lH刺激的黄体细胞中 cAMP积累和孕酮的分泌[32]。用 cuOOH处理5min即可抑制 lH刺激的孕酮分泌，而抑制 cAMP积蓄则必须要60min[33]。 cuOOH诱导孕酮分泌的抑制可能是由于半加 pG的产生。 cuOOH（25μ m）处理30min可显著地刺激 pGE2产生，而 pG合成抑制剂——马兜铃酸（100μ m）可完全阻断此反应[34]。 cuOOH可激活 pG合成关健酶——磷酸酶 a2，还能作用于 cAMP通路的某一环节，并且可将胆固醇转入线粒体。15（ s）-HPETE同样具有抑制 lH刺激的孕酮和其它甾体激素合成的作用[35]。因此，过氧化物抑制 lH刺激的孕酮分泌发生在 cAMP合成后，影响胆固醇合成甾体激素这一步，可能通过抑制蛋白质的合成。

　　总结

　　综上所述，黄体退化的机理很复杂，涉及细胞凋亡和体内诸多因子的参与。目前为止，探究得最多仍是 pG，它广泛存在于动物和人体内，而且类型较多，不同类型的有着不同的生理和药理活性。体内存在可诱导黄体退化的因子远非上述几种，更多的因子正在或有待于发现。综观当今溶黄体的研究资料，不难发现，其它学科，如细胞生物、发育生物、生化免疫及分子遗传学等的先进理论和技术正不断地被吸收并应用于生殖药理学的研究，推动木学科不断发展，如黄体细胞凋亡学说就是从近年提出的细胞凋亡学说发展而来的，使生殖药理从器官、细胞水平深入到 mRNA、 dNA直至基因调控上，若能发现调控黄化退化的基因组，在此基础上建立筛选溶黄体避孕新药的模型，我们相信有可能会找到控制生育的新药，进一步推动生殖药理学向前发展。

　　参考文献

　　1 zeleznik AJ et al. In The Phusiology of Reproduction ,2nd edition ,New York:Raven Press 1td ,Knobil Em, Weil JD, 193,751

　　2. juengel JH et al. Endocrinology,1993;132:249

　　3. fraser HM et al. J Endocrinol ,1995;147:131

　　4. toushun JO et al. Anat Rec ,1995;241:270

　　5. guo K et al. Biol Reprod ,1998;58:739

　　6. yuan W et al. J Clin Endocrinol Metab,1997;82:3148

　　7. kiya T et al. J Endocrinol Invest ,1998;21:276

　　8. sakamaki K et al. Mol Reprod Develop ,1997;47:11

　　9. quirk SM et al. Endocrinology ,1997;138:4558

　　10. lou LG et al. Acta Pharmacol Sin ,1996 ;17:255

　　11. zeleznik et al. Endocrinology,1989;125:2218

　　12. wyllie AH ,Br J Cancer ,1993:67:205

　　13. harrington EA et al. Eur Mol Biol J, 1994;13:3286

　　14. behrman HR et al. Reprod Med Rev ,1 993;2:153

　　15. bagavandoss PRC et al. Biol Reprod ,1990;42:367

　　16. fairchild DL et al. Biol Reprod,1991;44:357

　　17. benyo DL et al. Endocrinology,1992;130:854

　　18. toushun JO et al. Anat Rec ,1995;241:70

　　19. pizel L et al. Endocrinology,1993;126:67

　　20. fairchild DL et al. Biol Reprod ,1989;40:453

　　21. knauer L et al .J Cell Physiol ,1990;142:469

　　22. rabinovitch A et al. Endocrinology ,1990;126:67

　　23. michael AE et al. Mol Cell Endocrinol ,1994;99:R1

　　24. zelinski WM et al. Biol Reprod ,1990;43:507

　　25. ivell R et al. Biol Reprod, 1995;53:550

　　26. auletta FJ et al. J Reprod Fertil ,1994;102:215

　　27. auletta FJ et la. J Reprod Fertil ,1995;103:107

　　28. willian JM et al. Biol Reprod, 1994;51:800

　　29. mark PM et al. Endocrinology,1995;136:4963

　　30. margarita V et al. Free Radical Biol Med ,1994;17:493

　　31. riley JCM et al. Endocrinology ,1991;128:1749

　　32. rilry JCM et al. Endocrinology,1991;198:781

　　33. behman HR et al. Endocrinology,1991;128:2956

　　34. wang F et al. Biol Reprod ,1993;49:66

　　35. aten RF et al. Biol Reprod ,1992;46:401