表皮生长因子与胚胎发育和着床

　　摘要 　胚胎着床过程的调节十分复杂，近年来细胞生长因子参与胚胎发育和着床的功能研究十分热门，在细胞生长因子发挥作用的网络中，表皮生长因子起着举足轻重的作用，是着床过程顺利完成不可缺少的因子之一。本文就表皮生长因子改善胚胎发育、启动胚胎着床、调节植入过程等内容进行简要综述。

　　关键词：表皮生长因子 胚胎 发育 着床

　　自1962年Cohen从雄鼠颌下腺分离提纯出表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）以来，已证明EGF对多种组织来源的细胞增殖具有明显的促进作用。除颌下腺以外，人体的多种组织也EGF分布，如：十二指肠的Brnners腺、含中性粘蛋白的胃粘膜细胞系、外分泌腺体以及多种肿瘤细胞等。EGF还常见于包括精液、羊水在内的正常体液中。已经证实，在子宫内膜、蜕膜、着床前胚胎、滋养层细胞等生殖组织中存在EGF和/或EGF受体（EGF-R），EGF通过自分泌、旁分泌和内分泌途径，单独或通过细胞因子网络（cytokine net），参与内膜准备、胚胎发育、植入过程、妊娠维持、胎盘激素合成分泌等生理过程的调节[1～3]。

　　一、表皮生长因子及其受体

　　小鼠EGF是一种含53个氨基酸的单链多肽，编码小鼠EGF的信使核糖核酸（mRNA）含4 800对碱基，翻译出的EGF前体有1217个氨基酸残基，含数个糖基位点，与低密度脂蛋白（LDL）序列相似，因而EGF前体可能是一种有受体功能的膜糖蛋白。成熟的EGF分子内含3个二硫键，活性中心位于48～53个氨基酸残基之间，分子量为6.045kd，等电点4.6，耐热及耐胰蛋白酶、糜蛋白酶。不同种类的EGF虽然氨基酸数量和排列有差别，但存在一定的交叉反应。，人EGF首次从尿液中提取出来时，称作尿抑胃素（urogastrine），其生物学活性及氨基酸序列与小鼠EGF相似。

　　EGF-R是一种糖蛋白，广泛分布于哺乳动物的上皮细胞，是一条被质膜分为内、外两个区段的单一多肽链。EGF-R含1186个氨基酸残基，分子量170kd，富含甘露糖。人的EGF-R基因位于第7号染色体短臂上。除细胞膜外，核内也EGF-R分布，二者具有相同的抗原性。EGF-R的结构和功能在不同种属动物中基本相似，分子进化较保守。EGF-R本身具有蛋白激酶的活性，与配体的结合具有特异性、高亲和性等特点[1]。EGF-R在胎盘的分布比在子宫内膜、蜕膜等处要高1000倍，而且主要分布于合体滋养层[4]。

　　EGF家族的成员为数不少，由于它们的受体相同，因此或多或少地参与了胚胎的发育和着床的过程，研究较为广泛而深入的是EGF，其次是转化生长因子（TFG）和肝素结合表皮生长因子（HB-EGF），Amphiregulin、Cripto、Betacellulin、 neu以及Epiregulin与着床的调节只有少量报道[5]。

　　二、EGF与早期胚胎发展

　　着床的先决条件是胚胎的正常发育和脱透明带。Morita[6]用EGF处理体外培养的胚泡，然后移植入同步发情、处于假孕第4d受体母鼠的子宫内，结果着床率为77.9%，与在体内胚泡的发育接近，为84.2%，而体外培养未加EGF有胚泡，移植后的着床率只有57.1%。其原因可能是EGF显著刺激小鼠胚泡滋养层细胞的外延生长，增加与子宫内膜的粘附。Taga[7]1992年的实验显示，EGF对小鼠2细胞的发育不表现出明显的效应，只在桑椹胚以后，EGF自分泌和旁分泌才对胚胎的发育起作用。然而Buyalos[8]发现，将小鼠2细胞胚胎培养在EGF含量为2～100mg的培养液中，72h后，完全扩展和正在孵化的胚泡的比例明显高于对照组，且EGF的促进作用可被抗EGF抗体所阻断。Terual[9]将小鼠2细胞胚胎单独培养时，EGF可明显增加胚胎的分化生长速率，证明EGF对小鼠2细胞胚胎的生长有促进作用。EGF是否作用于早期胚胎取决于胚胎EGF-R的有无及活性，免疫荧光测定出小鼠未受精卵细胞和2细胞胚胎中呈现很弱的EGF-R荧光，4细胞以后各期，荧光逐渐增强。除滋养层细胞外，内细胞团中也EGF-R的表达，RT-PCR测出4细胞后EGF-R mRNA显著长高，说明从8细胞开始合成的受体蛋白源自胚胎的mRNA，而受精卵和2细胞胚胎内的mRNA则可能是母源性的[10]。

　　Merriman[11]将未受精的小鼠卵细胞在EGF的培养液中进行成熟处理，受精后分裂至2细胞阶段的能力高于对照组，将这些2细胞胚胎移植人受体假孕小鼠后，着床率为64%～78%，略低于正常着床率89%。Grupen[12]用EGF处理猪的卵细胞，发现能提高进行减数分裂的成熟卵细胞的比例，源于这些卵细胞受精后囊胚的形成率比对照组高，此结果表明，EGF对猪卵细胞的减数分裂和细胞质成熟具有重要作用。

　　EGF不仅对小鼠，而且在多种哺乳动物中都表现出对着床前胚胎发育具有调节作用。Johnson[13]证实在大鼠妊娠4、5、6d的子宫腺上皮中存在EGF、TGF-α和EGF-R，EGF-R同时还存在于正在植入的胚胎和子宫基质的蜕膜细胞上。Gharib[4]在绵羊围着床期滋养层细胞上也发现EGF-R存在，其分子量与小鼠EGF-R相同，为170kd，EGF和EGF-R的存在提示EGF参与了调节胚胎的发育。Zhang[15]从着床前的猪胚胎上同样发现分子量为170kd的EGF-R，该受体蛋白在有EGF和ATP时发生磷酸化。此外，在兔[16]、牛[17，18]、猫[19]、马[20]等动物的滋养层细胞和子宫内膜上都证实有EGF和EGF-R，EGF能够刺激体外培养胚胎的卵裂，使之更快发育至囊胚期。停滞发育（arrested development）是斑点鼬（一种小型食肉目哺乳动物）生殖生理的奇特表现，即胚胎着床前要经历180～220d的“休眠”，Paria[21]运用放射自显影技术显示，在斑点鼬子宫腺上皮、内膜基质、肌层和血管上存在EGF结合位点，进步用Northern杂交表明，延缓着床和围着床期间子宫和胚泡上均有类似于小鼠的EGF-R，分子量也为170kd的受体蛋白。用EGF分子诱导，仅在胚胎“苏醒”恢复发育时，EGF诱导的蛋白酪氨酸激酶（PTK）的活性才显著升高，在停滞发育时期，PTK活性无变化。这些结果表明，EGF在斑点鼬的胚胎发育调节中起着重要作用，特别是EGF-R的数量或功能状态可能是胚胎被激活以及着床的先决条件。

　　三、EGF与着床启动

　　在正常生理过程中，雌激素的第二次峰值对于胚胎着床的开始是必需的。Johnson通过切除大鼠垂体，同时给与孕酮支持建立胚胎延缓着床模型[13]，在这个模型中，由于缺乏雌激素，胚胎无法着床，但当给这些大鼠静脉注射100mgEGF，同时移植人延缓着床胚胎时，约有73%的大鼠子宫内发现了着床点，EGF虽然能够启动着床，但在体内是否参与雌激素的诱导着床作用以及作用方式如何尚不明确。Johnson[22]在另外一个实验中发现，如果在注射EGF1h前先给与消炎痛（indomethacin，一种前列腺素合成酶的抑制剂），EGF启动着床的作用可被阻断，但对雌二醇的作用则无影响，这个结果一方面说明EGF、雌二醇启动着床的途径可能不同；另一方面提示前列腺素参与调节着床过程。Tamada[23]测定了EGF对大鼠胚泡着床和蜕膜反应的影响作用。结果表明，在延缓着床大鼠的子宫腔内注射EGF，所诱导的着床效果与EGF呈剂量依赖关系，假孕5d的大鼠接受EGF宫腔注射后，蜕膜反应增强，提示EGF在胚胎着床和蜕膜化过程中可能发挥重要作用。EGF和雌二醇不同的启动着床途径在Chatterjee[24]的实验中得以验证，作者在用提纯的雌激素拮抗剂ICI-182780阻断雌二醇启动着床的效应时，却发现该拮抗剂并不影响EGF。

　　四、EGF与胚胎植入

　　1992年Hofmann[25]应用免疫组化方法证实人胚植人部位EGF和EGF-R，而且首次报道中间型滋养层（intermediaet rtophoblast,IT）也EGF和EGF-R分布，从而为EGF在人体早期妊娠胚胎植入过程具有调节作用提供了依据。EGF、EGF-R在滋养层的免疫活性表现呈下列规律：合体滋养层＞中间型滋养层＞细胞滋养层，分布差异的原因尚不明了。

　　有胚胎粘附、侵蚀、穿透子宫内膜过程中，子宫内膜细胞的凋亡涉及一系列蛋白酶的作用，如：细胞滋养层细胞（CTB）分泌的基质金属蛋白酶（MMP），它能消化内膜的细胞外基质；与之对抗的是蜕膜产生其抑制剂TIMPs；子宫内膜入滋养层还分泌一种调节酶剂，即纤溶酶原激活因子（PA，主要是尿激酶型uPA）。Harvey[26]在小鼠着床前和着床期子宫内膜中都测出TIMPs（1，2，3）和uPA受体有转录，但只在处于植入侵蚀阶段的胚胎中才第一次测出MMP-9和uPA的mRNA，原位杂交显示MMP-9于7.5d时植入胚胎周围的滋养层细胞高表达，而TIMPs则于紧邻植入胚胎周围的蜕膜中高表达，TGF-β1刺激TIMPs的产生。uPA主要表达于外胎盘锥，这样的表达方式保证胚胎精确地植入。Harvey的实验证明，EGF对这些酶的活性具有调节作用。他将妊娠4d的小鼠胚胎培养在含EGF的培养液中，2d后，其MMP-9和uPA的活性增强；白血病抑制因子（LIF）具有同样效应，但从第3d起，EGF失去刺激效应，LIF甚至抑制MMP-9和uPA的生成，此结果说明EGF与LIF一起参与了植入过程中蛋白激酶表达正确程序的建立。Miyauchi[27]进一步证实，EGF对uPA释放的刺激作用，同时还发现EGF刺激人体内膜细胞释放组织型PA（tPA）以及PA的抑制剂PAI-1，EGF对tPA和PAI-1释放的刺激作用在有孕酮存在时得以增强，推导EGF同孕酮一样参与着床，部分地通过调节纤溶酶原激活因子/纤溶酶系统来完成内膜组织凋亡、重建和细胞迁移。EGF启动着床的作用被消炎痛阻断这一现象提示，前列腺素可能是其发挥作用的环节之一，而前列腺素本身又是调节着床的重要因素之一，它可直接增加蜕膜细胞中uPA的转录和表达，调节细胞外基质[28]，同时刺激着床部位内膜毛细血管通透性增加，多种营养物质进入该部位，使得内膜疏松水肿而有利于着床。至于EGF与前列腺素相互作用关系还有待探明。最近发现[29]，通过蛋白激酶C途径磷酸化cAMP应答元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein,CREB）,EGF能促进滋养层细胞中人绒毛膜促性腺激素-α（hCG-α）基因的转录，而hCG对胚胎着床具有十分重要的意义。

　　胚泡粘附、植入时，同类因子中最早发挥直接作用的可能是HB-EGF[30]。表达于内膜上皮的HB-EGF可与细胞表面的两个位点结合：一是胚泡或滋养层细胞的EGF-R；二是滋养层细胞的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）。小鼠胚泡粘附一般发生在妊娠第4d晚上10点～11点，此前6～7h，HB-EGF开始表达。体外研究显示，HB-EGF可使胚泡的EGF-R去磷酸化，从而促进胚泡生长、透明带孵化以及滋养层的扩展生长。

　　五、EGF的调节

　　EGF是细胞生长因子网络中众多成员的一员，其功能既受因子之间、各种激素等活性物质的调节，又有其自身的旁分泌和自分泌调节，机制十分复杂，至今尚未完全明了。比较统一的观点是，EGF主要受到雌激素的调控。Kleinstein[31]用放射性配体结合法在兔和人的研究中发现，雌激素能够促进植入前子宫内膜表达EGF-R，雌激素拮抗剂可以阻断这种诱导效应，而孕酮并不影响标记EGF结合到内膜表面。不仅如此，小鼠胚泡中EGF-R基因的表达与母体雌激素状态密切相关，Paria[32]在小鼠妊娠第4d时切除其卵巢，以后每天（5～7d）注射孕酮，从而建立起延缓着床模型，第7d时，注射雌二醇，结果激活胚泡并发生着床。原位杂交技术可从正常妊娠D4胚泡中测出EGF-R的mRNA，但在休眠胚泡中检测不出。休眠胚泡在注射雌二醇8h后被激活，用半定量RT-PCR法测定，EGF-R的mRNA拷贝数增加了8倍。以上实验表明，雌激素对EGF和EGF-R的表达具有重要的调节作用。至于雌激素拮抗剂ICI-182780不影响EGF启动着床的原因，分析是雌激素与EGF发挥调节胚胎着床的作用层次和/或途径不一所致，雌激素可能通过多种途径参与调节胚胎着床，而EGF可能是这些途径中比较重要的一环。

　　EGF主要表达于子宫内膜，而EGF-R在内膜和胚泡（包括滋养层细胞）均有表达，但是在小鼠，EGF-R主要表达于子宫内膜的基质和肌层，在内膜上皮中，RT-PCR法未测到完整的mRNA分子，只测出转录分子的片段，这些片段不能翻译出有功能的EGF-R，而在着床前的囊胚中，完整的EGF-RmRNA十分丰富，由此提示，在胚胎——子宫内膜相互作用中，包括EGF、HB-EGF、TGF-α等EGF家庭成员的作用对象是胚泡，而不是子宫内膜上皮。

　　六、其它

　　Amphiregulin(Ar)、Cripto等生长因子与着床关系的研究始于近几年，报道的文献十分有限。Johnson[34]从未受精的小鼠卵细胞和早期胚胎未测出Ar的存在。Tsark[35]用多克隆抗Ar抗体和间接免疫荧光技术从桑椹胚和囊胚中测到Ar，Ar分布于胚胎细胞的胞质和核内，具有使胚胎加快进入囊胚阶段，同时增加胚胎的细胞数目的功能，TGF-α也可提高囊胚的形成，但不影响细胞数目，结果提示Ar以自分泌方式作用于小鼠着床前胚胎，其刺激细胞增殖、促进囊胚尽早形成的能力大于TGF-α。同样，Cripto的转录只在囊胚期才见到[35]，主要定位表达于胚胎的外胚层和随后快速生长的外胎盘锥。Xu[36]进一步发现，Cripto从囊胚期开始，逐渐表达于原条和心脏发生的部位，它对具有收缩性的心肌细胞分裂和分化的效应。Reese[5]证实，NDF表达于植入胚胎周围的子宫内膜中，在延缓着床的小鼠模型中，NDF不表达，而当注射雌激素、激活胚胎着床时，NDF很快恢复表达功能，此结果提示，NDF可能参与胚胎与内膜复杂的信号传递途径，对胚胎的激活是必要的。

　　七、结束语

　　EGF虽然在着床过程中表现出多种形式的功能，但就调节着床的因素而言，EGF的功能并不如雌激素、孕激素，甚至LIF、IL-1等因子更重要，研究EGF与着床的关系只是阐明胚胎着床机制中很小的组成部分，至于EGF在体内调节着床的完整功能尚有待人们去研究探讨。

　　*重庆医科大学医学超声工程研究所

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