内毒素激活内皮细胞的信号机制的研究进展

　　目前，尽管抗生素被广泛应用，并且有重症监护的支持，感染和中毒性休克(septic shock)仍然是住院病人，特别是创伤、烧伤和术后病人面临的一个严重问题，其死亡率高达35%～60%［1］。其中革兰阴性（G-）菌感染导致的中毒性休克是这类病人死亡的主要原因。虽然革兰阴性菌内毒素(endotoxin)，即脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的确切作用现在仍有争论，但它在启动体内免疫系统反应，导致中毒性休克中的重要性已得到普遍认识［2，3］。LPS介导细胞，特别是单核巨噬细胞激活，合成和释放各种细胞因子，再通过旁分泌或体循环作用于其它组织细胞，引起全身炎症反应综合征，严重者导致休克、多器官功能衰竭和死亡。然而，LPS除了通过髓样细胞发挥作用外，近年来越来越多的研究表明，内皮细胞在LPS引起的内毒素休克、多器官功能衰竭等病理过程中也起着关键的作用。除了通过单核巨噬细胞释放细胞因子间接对内皮发挥作用外，LPS还可通过直接途径激活或损伤内皮细胞，引起内皮细胞功能的变化，如粘附分子的表达、细胞因子的释放和屏障功能损伤等。这些变化在中毒性休克的发病中起着不可忽视的作用。本文着重探讨LPS激活/损伤血管内皮细胞的信号分子的调控机制以及未来研究所亟需解决的重要问题。

　　一、 LPS对内皮细胞的激活及其作用

　　LPS识别和信号传导是宿主对G-菌发生防御反应的关键。LPS是一种G-菌细胞壁成分，对体内多种细胞却是一种强烈的刺激因子，在中毒性休克组织和器官损伤中起着重要作用。LPS过度刺激髓样和间质细胞如单核巨噬细胞，诱导致炎细胞因子（proinflammatory cytokines）、趋化因子（chemokines）、生长因子（growth factors）和其他多种因子的生成，在内毒素休克的发生中起着关键的作用［4］。最近的研究证明，血管内皮细胞（endothelial cells, ECs） 、平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs）和成纤维细胞等实质细胞也是LPS作用的靶细胞。LPS对这些细胞的激活或损伤导致多种病理过程的发生［5，6］。早期实验表明，在炎症过程中白细胞和内皮细胞的粘附明显增加；而且，内皮细胞在LPS刺激时可释放组织因子和细胞因子［6］。进一步研究发现，内皮细胞受LPS刺激后可产生白细胞介素（ILs）、生长因子和一氧化氮,表达粘附因子和激活NK-κB，这些变化在局部组织损伤和修复、毛细血管渗漏综合征、弥散性血管内凝血、脓毒血症和多器官功能衰竭的发生中起重要作用。研究还发现，与正常相比，白细胞减少或缺失的动物对G-菌感染和LPS的敏感性没有变化［7］；临床观察也显示白细胞减少程度愈深，败血症发病率愈高。这也从另一个侧面表明，LPS对内皮细胞的损伤作用不一定依赖于白细胞的存在，而且这种损伤可能在内毒素休克以及由此带来的多器官功能衰竭的发生发展中起着重要的作用。

　　二、LPS介导内皮细胞激活的膜分子机制

　　过去几年，以阐明内毒素识别、摄取和信号传导为目标的研究已经兴起，为查明LPS导致内毒素休克的机制，探讨新型的治疗方法提供了新的思路。关于LPS介导细胞激活或LPS与细胞作用的分子机制，Ulevitch等［2］提出了一套完整的学说。学说认为，LPS介导的细胞激活需要血浆或细胞表面能够和内毒素结合的蛋白参与。这些蛋白包括LPS结合蛋白(LPS binding protein, LBP)和CD14。1986年Ulevitch实验室首先发现并克隆了LBP［2，8］。继而又发现了LPS-LBP复合物与CD14结合，介导细胞反应［2，8］。在哺乳动物，CD14存在着两种形式：一种是膜CD14 (membrane CD14, mCD14)，主要存在于髓样细胞如单核巨噬细胞表面，通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl-inositol GPI)连接于细胞膜的外侧，在LPS对髓样细胞系的激活过程中，LBP负责将LPS转运到细胞膜上与CD14结合，CD14与LPS形成复合物，通过跨膜信号分子将信号转导到细胞内［2］；另一种为可溶性CD14(soluble CD14, sCD14)，CD14可能缺乏GPI尾巴。在CD14的实质细胞如内皮细胞和表皮细胞，LPS介导的反应需要CD14的参与［2，5，8］。

　　CD14与多种传递信号的跨膜信号受体不同，没有跨膜区和胞浆内段，因此CD14不能直接和细胞内进行信号交流。目前认为，LPS受体属于“多构件受体”，包含至少两种以上的蛋白。CD14是主要的配基结合构件，其他蛋白介导LPS和CD14结合后的跨膜信号传导。LPS与其受体作用的不同模式［2，8］，一种模式认为信号分子本身并不直接和LPS结合，LPS与CD14结合后使其构型发生变化，再与细胞跨膜信号分子作用；另外一种模式为CD14使LPS能够直接和跨膜蛋白结合，预示着在CD14的情况下信号传递分子仍可直接和LPS结合，但其亲和力较低，表明CD14增强细胞对LPS的识别和反应，但对信号传导并不是绝对必需的。这就合理解释了CD14非依赖性信号传递。

　　由于对以单核巨噬细胞为代表的髓样细胞系研究较多，LPS激活细胞的作用模式也都是以髓样细胞为基础提出的。但近年来的研究表明，LPS也可直接激活或损伤内皮细胞，并且这种作用是sCD14依赖性的［5，9］。作为一种LPS结合蛋白，CD14在细胞激活过程中起着重要的作用，但其信号传递还需要其他蛋白质的参与，即跨膜信号传递分子，又称为跨膜受体（transmembrane receptor, Rt）。在实质细胞如内皮细胞，细胞膜上并不存在mCD14，LPS可与血浆蛋白sCD14结合，通过跨膜信号传递分子激活内皮细胞。曾推测内皮细胞与髓样细胞膜上的跨膜信号传递分子相同或具有某些共性，是一种受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性或在与LPS-sCD14结合后能够引起其它相关的酪氨酸激酶激活［2］。由于髓样细胞和内皮膜上与CD14复合物作用的 Rt至今仍未鉴定，因此，尚难确定这两种细胞膜上的Rt是否相同。但是由于它们激活细胞的方式具有某些共同的特点，因此，有理由认为两类不同细胞膜上的Rt可能具有某些共同的特征。发现并鉴定内皮细胞膜上的Rt是了解LPS 激活内皮细胞的关键，这除了可以丰富LPS受体的基本理论外，也将为内毒素休克的治疗提供一个靶子。

　　三、LPS激活细胞的细胞内信号传导机制

　　目前的研究表明，丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）在LPS引起的细胞反应中起着重要的作用［10］。在哺乳细胞至少已克隆了ERK5、JNK、p38和NEK5四个MAPK亚族［10，11］。这些不同的亚族激酶被不同上游激酶调节，并介导不同的细胞反应［11，12］。目前，虽然还没有关于LPS对ERK5通路影响的报道， 对其他MAPK亚族激活的报道已有不少［9，10］。

　　Weinstein等发现LPS刺激巨噬细胞导致细胞内的多个蛋白质磷酸化，其中两个磷酸化蛋白质ERK1和ERK2被确认为是MAPK超家族的成员。这提示酪氨酸激酶和MAPK超家族参与了LPS介导的细胞内信号传导，采取的是与其它配基如生长因子、细胞因子或激素相似的模式，LPS或LPS-CD14复合物与跨膜受体结合，启动一系列的快速反应，包括脂类递质形成，跨膜受体蛋白胞浆段的磷酸化和/或去磷酸化，几分钟后相继带来低分子量GTP酶通过适配蛋白(adaptor protein)在胞浆膜内侧聚集，使多个蛋白激酶激活。双位点特异性激酶MEK/MKK (MAP kinase kinase)被激活后，使MAPK临近的苏氨酸(threonine, T)和酪氨酸(tyrosine, Y) 磷酸化激活［11］。

　　细胞对LPS反应，引起多种蛋白发生酪氨酸磷酸化。在鉴定这些磷酸化蛋白质的研究中，除了已知的ERK外，还发现和克隆了一个新的MAPK，p38［10］。实验进一步证实p38可被细菌成分、致炎因子和细胞外物理-化学应激等激活［10，12］。Lee等发现p38能被一族以FHPI(即SB202190)为代表的吡啶异咪哒唑衍生物所抑制，而且这种抑制作用显著减少单核细胞的TNF-α产量。这一发现使人们普遍认识到p38在LPS诱导TNF生成中的重要性。最近，我们发现和克隆了三个新的p38亚型，即p38β、p38γ和p38δ［12，13］。而p38和p38β都能被FHPI所抑制，很显然这些不同亚型在介导LPS诱导的细胞反应中的差异是我们将来所要重点研究的问题之一。

　　LPS处理某些细胞导致多个MAPK通路的激活，但这种激活也可以是选择性的。譬如，在转染CD14的70Z/3细胞，LPS处理只导致p38激活而对ERK1和ERK2没有激活作用；用LPS处理人中性粒细胞只能激活p38而对ERK1/ERK2或JNK没有激活作用。

　　Arditi和Schumann等对LPS-sCD14复合物激活内皮细胞的细胞内信号传导进行了初步的研究，结果提示MAPK，特别是p38和ERK1亚族的酪氨酸磷酸化参与了这一传导过程［9，14］。对LPS刺激内皮细胞后激活MAPK的分子调节机制和特性仍不十分明了，有待进一步研究。

　　四、LPS引起细胞反应过程中MAPKs对转录因子的调控作用

　　LPS作用于细胞膜受体，通过细胞内信号传递级联使基因表达发生变化，最后引起细胞反应［8］。LPS介导基因表达的信号机制已成为一个广泛注意的研究领域，近年来已取得实质性的进展［8］。转录因子是MAPK细胞内的主要作用目标［11，12，15］。细胞受到刺激后，MAPK被磷酸化激活，然后移位到细胞核内，作用于相应的转录因子，使其发生磷酸化，从而启动某些基因表达，以完成刺激所介导的相应细胞反应［12］。譬如p38在细胞受到刺激后，对ATF2、MEF2C、CHOP10、SAP1等转录因子磷酸化，使启动子的转录活性增加，从而调控多种基因表达［12，15］。我们曾报道p38/p38β的激活可明显增加ATF2依赖性报告基因表达，表明p38对ATF2的磷酸化，可使其转录活性增加［12］。LPS刺激内皮细胞引起粘附蛋白，如ICAM-1、E-选择素、VCAM-1；细胞因子，如PAF、IL-1、IL-6；信号分子，如NO等表达的增加，在LPS等细菌毒素介导的细胞反应中起着重要的作用［6］。虽然这些转录因子在ICAM-1等内皮细胞反应蛋白基因表达中的作用仍未阐明，但MAPKs通过直接或间接的方式磷酸化激活转录因子，影响其基因转录活性，改变基因表达，可能是其对LPS诱导的内皮细胞反应发挥调控作用的重要机制。

　　尽管实验证明，在LPS直接刺激内皮细胞的过程中，ERKs和p38信号传导通路可被激活，即参与LPS引起的内皮细胞反应的MAPK主要是ERK和p38［9］，但其对粘附分子和细胞因子的表达调控机制仍未阐明。对转录因子在不同部位的血管内皮细胞发挥的转录调控作用的对比性研究可能使这一问题得到解决。探讨在LPS直接刺激内皮细胞的过程中，ERKs和p38介导细胞内信号传导，调节相应的粘附分子和细胞因子基因表达的作用和途径，将对感染、中毒性休克、全身炎症反应综合征的理论和临床防治有重要的意义。

　　五、LPS激活内皮细胞引起通透性增加的分子机制

　　内皮细胞的激活或损伤除了表现在各种粘附分子和细胞因子的合成和释放增多外，其屏障功能即通透性的变化也有重要意义。在多器官功能不全和衰竭的发生过程中，经常是首先有血管通透性的增加，此时血管通透性的增加主要是由于内皮屏障功能性的障碍，后期才有血管壁功能性的损伤［16］。

　　研究表明，内皮细胞形态变化和细胞间缝隙的形成决定了内皮细胞的屏障功能和血管的通透性。细胞与细胞、细胞与胞外基底膜间的粘附状态和内皮细胞的收缩力这两种力量在内皮细胞通透性的调节中相互制约，处于动态平衡，共同维持内皮屏障功能［17］。

　　实验证明，LPS作用于内皮细胞，可迅速引起细胞骨架蛋白的解聚和重组，细胞与细胞间和细胞与基底膜间的粘附连接松解，细胞间缝隙形成，最后导致微血管通透性升高［18］。但对于LPS引起内皮细胞骨架蛋白收缩重组的分子机制即细胞内信号传导途径不甚明了。一般认为，炎症递质直接或间接地与内皮细胞相应受体结合后，可通过磷酸酯酶C（PLC）分解二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）为三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG），IP3和DAG再分别激活以Ca2+和蛋白激酶C(PKC)为代表的两条信号通路，引起蛋白质如细胞骨架蛋白的磷酸化，最终导致细胞形态和粘附特性的改变，使内皮细胞屏障功能受损，通透性增加［17］。研究表明组织胺增加血管通透性的主要信号传导途径是Ca2+—一氧化氮合酶（NOS）—cGMP—cGMP依赖性蛋白激酶（PKG），而PKC代表了另一条信号通路，但与上述PKG通路有交互作用（cross talk），表现为PKC激活后通过调节NOS的活性，增加微血管通透性［19］。两条信号通路的激活都可以引起细胞骨架蛋白如肌球蛋白轻链的磷酸化，使内皮细胞收缩。也有研究证明，参与组成内皮细胞-基底膜粘附连接的一系列骨架蛋白如vinculin、paxillin和pp125FAK酪氨酸磷酸化也可导致内皮细胞通透性的增加［20］。

　　LPS通过与内皮细胞跨膜受体结合，激活酪氨酸激酶和PKG或/和PKC传导通路，引起细胞内靶蛋白的磷酸化，导致骨架蛋白的解聚和重组，最终使内皮细胞通透性增加［18，20］。阐明LPS直接激活内皮细胞引起血管通透性增加的信号传导过程，将可能为解决内毒素休克时的血浆外渗和血流淤滞提供一个新的途径。

　　六、未来展望

　　对内毒素休克病人的临床研究表明，阻断细胞因子的作用或阻断导致细胞因子释放的刺激的作用（LPS单克隆抗体），在临床试验的结果并不成功［21］。因此，深入研究LPS激活内皮细胞的分子调控机制显得更为必要。上述研究不但会丰富对内毒素性休克发生机制的认识，还将从以下几个层次为临床防治内毒素性休克和由此引发的多器官功能衰竭提供理论依据：(1) 对介导LPS激活内皮细胞的LPS-sCD14复合物跨膜受体的鉴定，将为寻找直接阻断LPS作用于细胞的抗体和/或抑制剂提供线索；(2) 对LPS激活MAPK及其亚族信号传导通路机制的研究，为从分子水平阻断LPS对内皮细胞的作用，减少炎症介质如各种粘附分子和细胞因子的产生和释放，从而为减轻炎症反应提供依据；(3) 对LPS刺激内皮细胞，增加血管通透性的细胞内分子机制的阐明，将可能通过阻断LPS激活或损伤内皮细胞的信号通路，防治内毒素性休克中由于内皮屏障功能障碍而导致的器官组织水肿和功能损害。因此，未来的研究不但会在LPS激活内皮细胞的分子机制上提出新的理论，而且可能会为临床上治疗LPS引起的内毒素性休克、全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭提供新的治疗途径。

　　作者单位：510515　广州，第一军医大学病理生理教研室全军休克微循环重点实验室

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