006右旋-氨基酸的研究进展

　　摘要　最近发现右旋-氨基酸，特别是右旋-天门冬氨酸和右旋-丝氨酸广泛存在于哺乳动物体内，提示人们关注右旋-氨基酸在哺乳动物生命活动中的意义。本文综述了右旋-氨基酸的分析方法、来源与生理特性。

　　关键词　右旋-氨基酸　分析方法　生理学

　　一般认为人体和生物蛋白质均由左旋（L）-氨基酸组成，但从50年代始逐渐有人报道一些生物和人体内也有右旋（D）-氨基酸，而且当时认为D-氨基酸与某些疾病或衰老有关［1～4］。但随着科学技术的进步和分析方法的发展，人们不断发现海洋动物、无脊椎动物、脊椎动物、藻类及种子植物等含有多种游离的D-氨基酸，特别是对哺乳动物体内右旋-氨基酸的研究，提示人们应对D-氨基酸在哺乳动物体内的生理意义予以关注。

　　1 d┐氨基酸的分析方法

　　1.1酶法　D-氨基酸氧化酶或D-天门冬氨酸氧化酶，在黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）存在的条件下，将D-氨基酸氧化为α-酮酸并与二硝基联苯肼反应生成腙，然后在445nm测吸光度［5］。空白对照组则加入蒸馏水代替D-氨基酸。此外还有D-氨基酸的定量方法，但并非对各个D-氨基酸定量，一般用氨基酸分析仪分离定量各种氨基酸的L-型和D-型总量，然后将剩下试液中的D-氨基酸在D-氨基酸转氨酶和2-酮酸存在下，生成α-酮酸和氨基正己酸后，将未反应的L-氨基酸再次经氨基酸分析仪定量，两者之差即为D-氨基酸的量［6］。

　　1.2气相层析法　该法由于具有分离效能高、分析速度快、样品用量少等特点，因而广泛用于科研和医药卫生、食品领域等。但其不足之处是在缺乏纯样品的情况下定性比较困难。因此色谱和光谱、质谱联用，可以发挥更大的作用。因氨基酸的极性大，挥发性小，故须加入一种最稳定且能定量衍生物的光学活性剂（N-三氟乙酰基正丁酯等），通过硅胶毛细管柱，根据光学活性区分开D-氨基酸与L-氨基酸［7］。利用L-缬氨酸结合型为固体相，被测样品中微量的D-氨基酸在固体相，而比较不稳定的L-型复合体则较早流出，因此可正确定量D-氨基酸。但样品中有6％～10％旋光化。

　　1.3效液相色谱法　最近广泛应用的高效液相色谱（HPLC）法具有明显的高性能，但用它来分析自身吸光度低的氨基酸，如机体内微量的右旋-氨基酸是很困难的。因此，可将氨基作为目标，使其与分子吸光系数大的紫外可见光试剂和荧光试剂反应，然后检测其反应结合物。为了检测准确，所用的试剂的光谱纯度必须为100％，且不易使反应物旋光化［8］。

　　D┐氨基酸的来源在生命起源之初合成的氨基酸为D-型和L-型。过去认为随着生物的进化，选择性地排除了D-氨基酸，从而使生物体内的蛋白质均由L-氨基酸构成。但最近10年来不断地在哺乳动物体内发现游离D-氨基酸，以下从两方面探讨其来源。

　　2.1近年来许多研究证实微生物、大鼠、鸡、鸽子、牛和人体中广泛存在D-氨基酸。最近，Nagata等［9］首次报道一些细菌、古生菌（archaea）及真核微生物的可溶性肽链上有D-氨基酸，用HPLC法分析发现，革兰氏阳性菌中丙氨酸和谷氨酸等的对映体比率为11.7％，枯草杆菌的谷氨酸对映体比率为22.3％；革兰氏阴性菌含有高浓度的D-天门冬氨酸；大鼠体内含有高浓度的D-丝氨酸，大脑皮质、海马及纹状体中分布最多，延髓、小脑和脊髓分布较少［10］。还发现不同年龄的人死后前脑皮质有高浓度的D-丝氨酸和D-天门冬氨酸。Huang等［11］报道，人尿中排出大量的D-丝氨酸，且排出量与年龄无关。成年狗尿中含有大量的D-丙氨酸，未断奶期和断奶期大鼠的D-丝氨酸的含量均很高，且随年龄增加而下降，但D-丙氨酸的含量则与年龄呈正相关。有人用分子生物学方法证实大鼠大脑和肾脏含有D-氨基酸氧化酶［12］。Dunlop等［13］用放射性同位素标记法证实大鼠大脑的D-丝氨酸直接来源于L-丝氨酸的异构体。用电镜和免疫组化方法证实牛肝和肾皮质含有D-天门冬氨酸过氧化物酶［14］。Kera等［15］首次证实鸡和鸽子肾脏也含有大量的D-天门冬氨酸和D-谷氨酸，鸡中这两种物质的含量与雌雄有关，而鸽子中的含量则与雌雄无关。此外，甲壳类、头足类、鸟类的神经组织中D-天门冬氨酸含量也很高。机体内代谢速度缓慢的蛋白质如珐琅质、牙质、脑白质、骨髓磷脂碱性蛋白和晶体核，每年约有0.1％旋光化。Fujii等［16］首先观察了不同年龄的人眼晶体蛋白中天门冬氨酸的异构化，指出在晶体存活早期（11个月）就有氨基酸的异构化，并且随年龄增加异构化也增加。

　　2.2　外源性　含有D-氨基酸的食物很多，如发酵食品和经碱、热处理的食品，天然食品如海带、野菜、苹果和梨的细胞质、甲壳类（大虾和螃蟹等）均含有D-氨基酸。据估计，西方人食源性D-氨基酸中有1／3来自发酵食物，成为人体D-氨基酸的主要来源。其原因有两方面：一方面由于人们长期味觉实践的结果，能够比较出许多氨基酸的两种对映体味道甘苦不同，而D-型多为甘味，因此人们通过一些办法使食物中产生更多的D-氨基酸以改善食品味道；另一方面在于加工食品中所利用的细菌、霉菌、酵母本身含有各种D-氨基酸，例如细菌的细胞壁含有D-丙氨酸和D-谷氨酸衍生物，在酵母孢子中含有D-酪氨酸。弯曲乳杆菌（L．curvaturs）的乙醇提取液中D-丙氨酸高达79％，D-天门冬氨酸达31.7％，D-谷氨酸为46.7％；瑞士乳杆菌（L．helveticus）中D-丙氨酸为59.2％，D-天门冬氨酸为48.5％，D-谷氨酸为41.6％等［17～19］。另外，有人用放射性标记外源性的D-丙氨酸和D-天门冬氨酸喂饲小鼠，发现其肝、肾和脑均有放射性标记的D-氨基酸，这表明外源性的D-氨基酸随血流进入各组织。某些药物（抗生素、利尿药及降糖药等）也会使体内D-氨基酸水平上升。

　　3　D┐氨基酸的生理特性

　　3.1　某些细菌和两栖类的必要成分

　　Liu等［20］最近指出D-谷氨酸是E．coli细胞中谷氨酸的对映体，是一些细菌必不可少的成分。因此，补充D-谷氨酸对细菌生长有益。Kreil［19］指出，两栖类的肽链上含有的D-氨基酸来自于由L-氨基酸构成的多肽的前体。

　　3.2　调节神经组织功能

　　Hashimoto等［21］指出，大鼠的大脑和末梢神经组织含有高浓度的D-天门冬氨酸和D-丝氨酸，它们对器官功能成熟和细胞增殖分化有调节作用。另一些研究指出，任何哺乳动物组织的松果体都含有大量的D-天门冬氨酸。此外，在肾上腺、骨髓、脑垂体中均含有D-天门冬氨酸，它可调节神经内分泌功能［22～24］。

　　3.3　可作为活化因子或用于治疗

　　Hess等［25］发现谷氨酸、N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）、甘氨酸和D-丝氨酸对人NMDA亚型1A／2D的作用明显高于其它亚型。动力学测定显示人体内的NMDA1A／2D对谷氨酸和甘氨酸有很高亲和力的原因可能是由于1A／2D的兴奋剂（agonist）解离较慢。该亚型1A／2D显示为一种具有特殊药理功能的受体并能构成一种重要的活化因子。另外，D-丙氨酸可使体内D-氨基酸氧化酶（DAAO）在肿瘤细胞质中异位表达，阻止体内脂质氧化损伤，清除细胞毒性。例如用培养的神经胶质瘤细胞为实验材料，用分子生物学技术导入从红酵母中纯化的DAAOcDNA，然后加入不同浓度的D-丙氨酸，发现加入1.5～2.5mmol／LD-丙氨酸时，DAAO有明显表达，且有剂量依赖性。还发现该细胞的IC50，D-丙氨酸浓度为2.6mmol／L。因此，有人建议D-氨基酸可作为一种新的癌基因治疗措施［26］，也有人认为血液渗析患者尿中的D-天门冬氨酸含量较正常人尿中少，是因为此病患者的转甲基酶诱发蛋白质修复，并能明显改善疾病［27］。

　　4　展望

　　过去一直认为哺乳类的蛋白质完全由L-型氨基酸构成。本文综述了广泛存在于哺乳动物体内的D-氨基酸及其生理特性，提示对D-氨基酸的生理活性应予以关注。随着分析方法的发展，可望对D-氨基酸在哺乳动物体内的合成、代谢途径、各类D-氨基酸的依存关系以及人尿中D-氨基酸的来源有新的突破。

参 考文 献

　　1 mastersPMandBadaJL．Nature，1977，268：71-73．

　　2 hashimotoAetal．FEBSLett，1993，331：4-8．

　　３ShimoyamaAandHaradaK．ChemLett，1984，1661-1664．

　　4 fisherGHetal．NeuroscienceLett，1992，143：215-218．

　　5 D＇AnielloAetal．JBiolChem，1993，268：26941-26949．

　　6 JonesWMetal．AnalBiochem，1994，218：204-208．

　　7 schiberAetal．JChromatogr（B），1997，691：1-5．

　　8 ChamWCetal．JChromatogr，1995，697：213-215．

　　9 NagataYetal．BiochimBiophysActa，1998，1379：76-82．

　　10 hashimotoAetal．JNeurochem，1993，60：783-786．

　　11 HuangYetal．BiolPharmBull，1998，21：156-162．

　　12 KonnoRetal．BiochimBiophysActa，1997，1335：173-181．

　　13 dounlopDSandNeidleA．BiochemBiophysResCommun，1997，235：26-30．

　　14 ZearK．JHistochemCytochem，1996，44：1013-1019．

　　15 KeraYetal．CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol，1996，115：121-126．

　　16 FujiiNetal．JBiochem，1994，116：663-669．

　　17 bruueknerHetal．Chirality，1993，5：385-392．

　　18 SolmsJ．JAgrFoodChem，1969，4：686-695．

　　19 KreilG．JBiolChem，1994，269：10967-10970．

　　20 LiuLetal．BiosciBiotechnolBiochem，1998，62：193-195．

　　21 hashimotoAandOkaT．ProgNeurobiol，1997，52：325-353．

　　22 schellMJetal．ProcNatlAcadSciUSA，1997，94：2013-2018．

　　23 LeeJAetal．BiochemBiophysResCommun，1997，231：505-508．

　　24 hamaseKetal．BiochimBiophysActa，1997，1334：214-222．

　　25 HessSDetal．JNeurochem，1998，70：1269-1273．

　　26 stegmanLDetal．HumGeneTher，1998，9：185-193．

　　27 pernaAFetal．JAmSocNephrol，1997，8：95-104．